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雌激素是子宫内膜癌的致病因子,雌激素与经典的核受体结合后,介导基因组信号(genomic signaling)的产生,参与子宫内膜癌的发生进展。GPR30是一种新型的雌激素功能性膜受体,是G蛋白偶联受体超家族的成员,与经典的核受体不同的是,雌激素与GPR30结合后介导雌激素的快速非基因组效应(nongenomic signaling),引起细胞内酶的活化、第二信使的产生和信号传导,因此GPR30可能在子宫内膜癌中也发挥重要的调控作用。本研究拟采用RT-PCR、Realtime PCR、western blot、RNAi、裸鼠荷瘤模型等技术和方法,研究GPR30在子宫内膜癌发生进展中的调控作用,阐明GPR30作用的分子机理以及参与GPR30发挥作用的信号传导机制,补充现有的对子宫内膜癌发生进展的认识,有助于找到药物治疗的新靶点,为临床诊断、治疗和预后预测提供理论依据。
首先,探讨雌激素膜受体GPR30在子宫内膜癌中的表达及其意义。方法:RT-PCR和免疫组织化学法检测子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中GPR30mRNA和蛋白表达,分析GPR30的表达与临床病理联系;免疫细胞化学分析GPR30蛋白在子宫内膜癌细胞系RL95-2(ER+)和KLE(ER-)中的表达。结果:子宫内膜癌组织中GPR30的mRNA的表达水平显著高于正常子宫内膜组织(p<0.05);子宫内膜癌组织中GPR30蛋白表达的阳性率(21/30例,70%)显著高于正常子宫内膜组织(5/17例,29.41%)(χ2=7.232,P=0.007);且肿瘤分级越高,GPR30表达阳性率越高(p=0.003),但GPR30表达与内膜癌分期、肌层浸润深度和腹水转移无关(p>0.05);结论:雌激素膜受体GPR30表达于子宫内膜癌组织,且其表达与肿瘤高分级存在相互联系,提示GPR30可能在子宫内膜癌中发挥重要的作用。
其次,探讨雌激素膜受体GPR30在子宫内膜癌细胞中的表达及其诱导的细胞内信号通路的活化。方法:RT-PCR和免疫细胞化学分析GPR30蛋白在子宫内膜癌细胞系RL95-2(ER+)和KLE(ER-)中的表达;ELISA和western blot检测雌激素(17β-estradiol)和GPR30激动剂G1处理后子宫内膜癌细胞系RL95-2和KLE中MEK和ERK的活化水平;结果:雌激素膜受体GPR30表达于ER阴性(KLE)和ER阳性(RL95-2)的子宫内膜癌细胞系,雌激素和GPR30特异性激动剂-G1能激活上述两种细胞内的MEK/ERK MAPK信号通路。结论:雌激素和G1经GPR30介导的MEK/ERK MAPK信号通路的激活有可能参与子宫内膜癌细胞的调控。
最后,探讨了经GPR30介导的非基因组效应(MEK/ERK MAPK信号通路激活)引起的雌激素和G1的效应对子宫内膜癌生物学功能的调控和肿瘤形成的影响。方法:运用RNAl干扰的方法筛选GPR30稳定干扰的RL95-2和KE细胞系,Real time PCR检测干扰效率;用CCK8方法分析雌激素(17β-estradiol)和G1处理后RL95-2和KLE细胞的增殖情况,并观察MEK/ERK/MAPK特异性抑制剂U0126对RL95-2和KLE细胞增殖的影响;用Western blotting、ELISA明胶酶谱和方法分别检测雌激素(17β-estradiol)和G1处理后RL95-2和KLE细胞MMP2,MMP9的表达、分泌和活性,并观察MEK/ERK/MAPK特异性抑制剂U0126和G蛋白抑制剂PTX对RL95-2和KLE细胞侵袭能力的影响;Matrigel侵袭实验观察雌激素(17β-estradiol)和G1对RL95-2细胞系侵袭能力的影响结果:雌激素(17β-estradiol)和G1均能通过GPR30经由MEK/ERK/MAPK信号通路促进上述两种细胞系的增殖,侵袭和IL-6的分泌,参与子宫内膜癌肿瘤的发生发展。结论:GPR30介导的雌激素非基因组效应参与子宫内膜癌的生物学功能的调控,并能促进子宫内膜癌肿瘤的发生,同时GPR30在子宫内膜癌肿瘤发生发展中发挥重要的作用。