利用64排螺旋CT灌注成像技术，通过对兔VX2肾移植瘤模型及肾癌进行CT灌注成像，测量各自的CT灌注值，与正常组比较并进行统计学分析，探讨肾癌的血流动力学变化规律；利用免疫组化技术，检测肿瘤血管生成量化指标微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)，并与癌旁肾皮质比较，探讨肾癌CT灌注参数与MVD、VEGF等量化指标的相关性，从而评价CT灌注成像反映肾癌血管生成的临床应用价值。第一部分兔VX2肾移植瘤模型64排螺旋CT灌注成像研究研究目的建立兔VX2肾移植瘤模型，通过对兔VX2肾移植瘤模型的64排螺旋CT灌注成像，探讨兔VX2肾移植瘤血流动力学变化规律，为研究人类肾癌提供理论依据。材料与方法1主要仪器与试剂Brilliance 64排螺旋CT扫描仪(荷兰PHILIPS公司)，配置有Mxview(带有肾脏灌注软件)工作站，双筒高压注射器(美国MEDRAD公司)；非离子型对比剂典比乐(370mgI／ml)。2实验资料2．1实验对象分组20只新西兰大白兔，体重2-2.5kg，雌雄不限。随机将实验动物分为实验组和正常对照组。2．2兔VX2肾移植瘤模型的建立荷瘤VX2新西兰种兔一只，将瘤细胞接种兔后腿的皮下成瘤并传代，制成种兔。选取2周左右种兔切除肿瘤，取瘤块边缘生长旺盛组织，制成1-2mm~3大小碎块。采用切开后腹壁暴露肾脏瘤块直接包埋法种植，建立兔VX2肾移植瘤模型。饲养16-20天进行实验。2．3 CT灌注成像技术与方法先常规全肾轴位平扫，层厚2.5mm，间距2.5mm，再行宽范围同层动态增强扫描，设定最宽扫描范围40mm，使用双筒高压注射器，注射速率1.5ml／s；先注射非离子型对比剂370mgI／ml典必乐4ml，后注射生理盐水2ml，注射后延迟1秒钟开始扫描，共扫描50次，总时间50s。灌注扫描主要参数有：探测器排列64×0.625mm，无间隔连续扫描，层厚2.5mm，电压120KV，电流150mAs，360度旋转时间0.5s。感兴趣区(ROI)的选取：包括主动脉、肾静脉、肿瘤实质及肾皮质。主动脉和肾静脉可为圆形或椭圆形，肿瘤实质及肾皮质可为不规则形。ROI尽可能大，不能小于50个像素，以减少量子噪声，但不能达到器官的边缘以避免部分容积效应的影响，实质区ROI尽量不包括‘肾窦脂肪，病灶则应避开坏死区。3图像后处理、数据收集及观察在Mxview工作站上，应用自带的灌注软件进行图像后处理。腹主动脉代替肾动脉被确定为输入动脉，肾静脉被确定为输出静脉。划出腹主动脉、肾静脉、肾皮质感兴趣区(region of interest，ROI)，软件自动测量出各ROI的CT值，并绘制出时间—密度曲线(time density curve，TDC)和灌注彩图，根据TDC，软件自动生成显示灌注指标，包括。肾脏血流量(blood flow，BF)、肾脏血容量(blood volume，BV)及对比剂的平均通过时间(mean transit time，MTT)等。研究期间所有的测量均重复2次，取其平均值。观察TDC形态并收集、记录实验组和对照组BF、BV、MTT等灌注参数。4病理学观察常规苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察正常肾及肿瘤的组织结构。5统计学分析采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。各项灌注参数指标以平均数±标准差表示，数据采用两独立样本t检验，P＜0.05，被认为显著性差异。结果1兔VX2肾移植瘤模型大体形态及病理学观察10只新西兰大白兔均成功长出肿瘤，大小范围0.6-1.4cm，最小者直径0.6cm，边缘光滑，密度均匀；最大者直径1.4cm，边缘大部分光滑，小部分欠光整，中央部见小片坏死区，部分瘤体突出于肾包膜之外。VX2移植瘤组HE染色见肿瘤细胞核大、异型、深染，呈混乱簇状及乳头状排列；对照组肾组织HE染色可见基本正常的肾小球及肾小管，结构基本规则，细胞形态良好。2时间-密度曲线(TDC)特征主动脉TDC：依据先后分为基线段、上升段、下降段及水平段4阶段。基线段较平直；然后骤然上升形成波峰，上升段和下降段表现为骤升骤降；然后是较平直并缓慢下降的水平段。肾静脉TDC：基线段较平直，维持时间较长；然后大约在主动脉峰值之后上升形成波峰，并下降较快，表现为速升速降；波峰明显低于主动脉，时间跨度长于主动脉；之后缓慢下降，也可见到小的再循环峰。正常对照组肾脏TDC：基线段较主动脉的TDC稍长，上升段较陡，但陡度小于主动脉，达到峰值后缓慢上升一段时间再缓慢下降，表现为速升速降，然后是较平直并缓慢下降的水平段。移植瘤组TDC：与正常组相似，但开始上升时间向后推移，上升速率减慢，上升段明显平缓，幅度减低，且峰值出现时间迟于正常肾皮质。3正常对照组、移植瘤组BF、BV、MTT灌注参数比较正常对照组BF、BV、MTT分别是(114.2±58.6)ml／(min.100mg)、(107.9±99.1)ml／100mg、(22.4±19.1)s，移植瘤组BF、BV、MTF分别是(24.6±14.3)ml／(min．100mg)、(106.7±64.5)ml／100mg、(40.9±13.1)s。两组BF、MTT比较，参考值P＜0.05，被认为显著性差异；两组BV比较、参考值P＞0.05，统计学无显著性意义结论1通过采用切开后腹壁直接包埋种植法，可获得稳定的兔VX2肾移植瘤模型。2兔VX2肾移植瘤模型CT灌注参数BF低于正常肾皮质，MTT则高于正常肾皮质，CT灌注在一定程度上能反映出VX2移植瘤的血流动力学变化规律，为研究人类肾癌提供理论依据。第二部分肾细胞癌64排螺旋CT灌注成像与MVD及VEGF的相关性研究研究目的利用64排CT灌注成像技术，探讨肾细胞癌血流动力学变化规律，重点为肾癌BF、BV、MTT等CT灌注参数与肿瘤微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)之间的关系。材料与方法1主要仪器与试剂同第一部分。2研究对象正常对照组10例：分左、右肾两组。肾细胞癌组15例：均经手术病理证实为肾细胞癌，病理类型：透明细胞癌8例，颗粒细胞癌4例，乳头状癌3例；肾细胞癌组与同侧癌旁肾皮质(距离肿瘤边缘2.0cm以上)作为比较。3扫描方案及参数常规扫描：先常规轴位平扫中腹部，再行全肾灌注模式(按设定程序，床板循环往复移动)扫描，利用双筒高压注射器，注射速率5ml／s，先注射非离子型对比剂370mgI／ml典必乐40ml，后注射生理盐水20ml，注射后延迟8秒钟开始扫描，扫描15次。扫描参数主要有：探测器排列64×0.625mm，层厚5.0mm，间距5.0mm，Pitch1.156，120KV，100mAs，360度旋转时间0.4s，扫描间隔时间4.7-5.6s(默认最小)，总时间为85-90s。4图像后处理及数据收集同第一部分。注意个别受检者因呼吸影响出现图像漂移时，要用微调通过手工进行逐层校正，以保证TDC的正确和完整。5病理检查和免疫组化观察方法5.1病理制作准备肿瘤组织的取材部位与CT灌注图像所选的ROI一致。每个组织块连续切片3张，层厚为4μm，一张HE染色用于普通病理诊断，一张用于MVD免疫组化染色，另一张用于VEGF免疫组化染色。5.2 MVD计算方法参照Weidner等的判断标准，首先在100倍光镜下浏览全片，寻找肿瘤血管高密度区，选定4个血管密度最高区在高倍镜下(200倍)观察，在目镜网格测微尺0.25μm~2的范围内计数，将4个视野血管数目进行平均，取其平均值。5.3 VEGF检查的标本的制作及结果分析标准血管内皮生长因子检测采用链霉素-生物素-过氧化酶连接法(streptavidin-biotin-peroxidase，SP法)进行免疫组化染色，二甲基氨联苯胺(diamino benzidine tertrahydrochloride，DAB)显色试剂盒，进行VEGF的检测和量化分析，所用试剂盒均购自Roche公司。DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片，用已知阳性标本做阳性对照，对照组由磷酸缓冲液(PBS)代替一抗。VEGF表达结果的判断采用兼顾VEGF阳性染色的强度和阳性细胞所占的百分比作为判断标准。VEGF阳性表达定位于肿瘤细胞浆中，首先将细胞浆染色强度打分，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，再将阳性细胞所占的百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10％，2分为11％～50％，3分为51％～75％，4分为＞75％。染色强度与阳性百分比的乘积＞3分为免疫反应阳性。并按乘积分数分为4个等级：-(0，1，2分)、+(3，4分)、++(6，8分)、+++(9，12分)。6统计学分析所有计数资料数据用均数±标准差(x±s)表示，经SPSS13.0统计软件分析，两两样本均数的比较用t检验；多个样本均数的比较用方差分析。等级资料的比较用非参数检验，对于肾癌实质BF与MVD和VEGF表达之间的关系分别采用Pearson相关分析和Spearman’s相关分析法。P＜0.05，统计学有显著性差异。结果1 TDC形态1.1主动脉及肾静脉TDC形态：同第一部分，形态较实验兔肾高耸。1.2正常肾脏TDC形态表现肾皮质TDC呈速升缓降型，峰值出现在主动脉峰值之后，上升段的形态与主动脉类似，但较主动脉平缓，幅度低，下降段在快速轻度下降后，维持缓慢下降的平台期。1.3肾癌TDC形态表现依据肾癌CT灌注的TDC形态不同将15例肾癌分为富血供和乏血供两型，其中8例为富血供肾癌，判断标准为：瘤体TDC形态类似于主动脉TDC，曲线上升幅度及陡峭程度均稍低于腹主动脉，上升段呈较陡的上升型曲线，而下降段不明显，水平段延长；7例为乏血供型肾癌，判断标准为：肿瘤实质TDC曲线与腹主动脉TDC明显不同，曲线上升幅度及陡峭程度明显低于腹主动脉，上升段较缓慢，下降段不明显，有的可呈波浪状。2正常左、右侧肾皮质灌注参数比较左侧肾皮质BF(182.99±25.89)ml／(min．100mg)、BV(109.74±13.07)ml／100mg、MTT(9.50±3.13)s；右侧肾皮质BF(190.68±33.68)ml／(min．100mg)、BV(122.84±19.75)ml／100mg、MTT(8.70±3.30)s。左、右肾皮质灌参数BF、BV、MTr比较，P＞0.05，统计学无显著性差异。3肾癌组与同侧癌旁肾皮质灌注参数比较肾癌组BF(133.0±29.9)ml／(min．100mg)、BV(107.2±23.1)ml／100mg、MTF(15.6±6.5)s，同侧癌旁肾皮质组BF(166.1±26.0)ml／(min．100mg)、BV(84.8±31.6)ml／100mg、MTT(11.3±3.3)s，两组间P＜0.05，统计学有显著性差异。4 CT灌注参数与MVD、VEGF的关系4.1肾癌和同侧癌旁肾皮质VEGF的表达15例肾癌组织中VEGF表达阳性者12例，同侧癌旁肾皮质组织则无VEGF阳性表达，经非常参数检验，两组间P＜0.05，统计学有显著性差异。4.2肾癌和同侧癌旁肾皮质中CD34的表达肾癌组织与同侧癌旁肾皮质MVD在200倍视野下测量值分别为：122.2±25.4条、28.2±14.7条。经独立样本t检验，两组间P＜0.05，统计学有显著性差异。5 CT灌注成像参数值、VEGF及MVD的相关性5.1 VEGF的表达与MVD之间的相关性VEGF表达阳性的。肾癌病人的MVD值明显高于VEGF表达阴性者，经Spearman相关分析VEGF表达和MVD之间呈正相关(r=0.870，P=0.000)。5.2肾癌CT灌注参数值BF、MTT与MVD的相关性对肾癌组中MVD和BF、MTT的采用Pearson相关分析，发现肿瘤实质的BF值与MVD呈正相关(r值为r=0.565，P=0.028)，MTT与MVD呈负相关(r值为r=-0.878，P=0.000)。5.3肾癌组CT灌注参数值BF与VEGF的相关性对肾癌组中的VEGF和BF经Spearman相关分析，(P=0.06＞0.05)，统计结果表明VEGF表达和灌注参数值BF之间尚不能认为有相关性。结论1肾细胞癌CT灌注参数与癌旁肾皮质比较BF减低，而BV增高，MTT延长。CT灌注参数可以反映出肾癌组织血流动力学与正常肾皮质明显不同。2肾癌CT灌注参数BF值与MVD存在正相关，MTT与MVD呈负相关；而VEGF在肾癌组织中表达较高，在癌旁肾皮质中表达较低。因此CT灌注成像可以在一定程度上反映肾癌的血管生成状况。