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研究背景及目的：白血病是危害人类健康的高发恶性肿瘤之一。近年来,尽管白血病的治疗取得了进展,但是仍有部分患者出现复发和转移导致病情恶化。我们的前期研究表明趋化因子受体-9 (Chemokine receptor 9, CCR9)特异性高水平表达于急性T淋巴细胞白血病(T lineage acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)CD4+白血病细胞上,而罕见表达于正常T细胞,并与白血病细胞的化疗药物抵抗和转移密切相关。因此,CCR9极有可能成为新的介导T-ALL治疗的靶标分子之一。本研究探讨利用CCR9的特异性配体CC型趋化因子-25 (CC chemokine25,CCL25)和铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)截短型片段PE38构建重组免疫毒素CCL25-PE38,观察其对T-ALL细胞系MOLT4(天然高水平表达CCR9)的杀伤作用,以期为T-ALL的靶向治疗提供基础。‘研究内容和方法：首先运用重叠延伸PCR (Gene splicing by overlap PCR, SOE-PCR)的方法合成CCL25基因片段,通过PCR从pRB391质粒克隆PE38基因,然后利用SOE-PCR方法合成免疫毒素全长基因片段CCL25-PE38。将合成的CCL25-PE38、PE38片段定向克隆至pET32a(+)、pET30a(+)、pcDNA3.1构建其表达载体pET32a(+)-CCL25-PE38/-PE38、pET30a(+)-CCL25-PE38/-PE38、pcDNA3.1-CCL25-PE38/-PE38。将原核表达载体转化E.coli Rosseta、BL21诱导目的蛋白表达,真核表达载体转染293T细胞表达分泌性蛋白,通过SDS-PAGE、Western Blot、共聚焦显微术检测目的蛋白的表达和分布情况。通过流式细胞术、共聚焦显微术检测CCL25-PE38与MOLT4细胞的结合及内化,Transwell趋化小室检测其趋化能力,细胞增殖试剂WST-1检测其细胞杀伤能力,Annexin V-FITC/PI染色检测其凋亡诱导效应,建立SCID小鼠白血病细胞异种移植肿瘤(CCR9+肿瘤)模型检测CCL25-PE38的抑瘤效果。研究结果：经酶切鉴定、DNA序列测定等证实,成功克隆了免疫毒素CCL25-PE38基因并获得其原核和真核表达载体。pET32a(+)-CCL25-PE38/-PE38、pET30a(+)-CCL25-PE38/-PE38在E.coli Rosseta、BL21中经IPTG诱导获得了表达,SDS-PAGE和(?)(?)estern Blot证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。通过共聚焦显微术和Western Blot检测发现pcDNA3.1-CCL25-PE38/-PE38在293T细胞中获得了表达,并可分泌至细胞培养上清中；流式细胞术和共聚焦显微镜术结果显示CCL25-PE38能特异性结合MOLT4细胞并内化进入细胞浆；WST-1检测结果显示CCL25-PE38能特异性杀伤MOLT4细胞；Annexin V-FITC/PI染色显示CCL25-PE38主要通过凋亡诱导效应引起MOLT4细胞死亡；在SCID小鼠白血病细胞异种移植瘤模型中,注入CCL25-PE38能缓解CCR9+肿瘤的生长。研究结论和意义：成功克隆重组免疫毒素CCL25-PE38基因,免疫毒素CCL25-PE38能够在原核和真核表达系统得到表达。CCL25-PE38特异性结合CCR9并内化进入MOLT4细胞,通过凋亡诱导作用引起MOLT4细胞死亡,缓解异种移植CCR9+肿瘤的生长。本研究为T-ALL的靶向治疗提供了潜在的策略。