背景和目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类最常见的消化道肿瘤之一,发病率及病死率高。结直肠癌手术后的复发和转移是导致治疗失败的主要原因,传统的放、化疗效率低,毒副作用大,远远不能满足临床需求。血管生成在肿瘤特别是实体肿瘤的生长、侵袭和转移过程中起了至关重要的作用。抗血管生成药物已被广泛应用于临床结直肠癌的治疗,但在增加中风和动脉血管事件危险性、消化道出血、穿孔、伤口延迟愈合等不良反应的同时对结直肠癌患者长期生存期的延长效果不理想。临床中寻求抗血管生成治疗的新靶点对结直肠癌的治疗非常重要。胆固醇是细胞膜的重要组成部分,在细胞的生物活动中扮演着重要的角色。已有研究表明高胆固醇饮食是结直肠癌发生发展的危险因素,并且结直肠癌患者存在低胆固醇血症及粪便胆固醇升高的现象,胆固醇代谢的关键酶HMG-Co A还原酶在结直肠癌中表达上调,提示结直肠癌患者存在胆固醇合成及吸收的紊乱。HMG-Co A还原酶抑制剂对血管生成具有双向调控的作用,高剂量长期使用具有一定的抗血管生成的作用。胆固醇合成末端酶鲨烯环化酶抑制剂、伊曲康挫都有抗肿瘤血管生成的作用。由此可见胆固醇代谢可在一定程度尚影响结直肠癌的血管生成。并且已有文献报道内皮细胞胆固醇的排出能够影响血管生成,但肿瘤细胞本身胆固醇转运对血管生成的影响尚无文献报道。胆固醇代谢过程复杂,涉及了多种代谢酶及转运体,其对结直肠癌具体影响尚不十分清楚。由此我们推测结直肠癌发生发展过程中胆固醇合成的其它重要的限速酶及相关转运蛋白可能会出现表达的改变。3β-脱氢胆固醇-Δ24还原酶(3β-hydroxysterol?(24)-reductase,DHCR24,Seladin-1)催化固醇中间体C-24,25双键的形成,它参与了从羊毛甾醇催化合成为胆固醇过程中的19个催化反应,是胆固醇合成末端重要的酶。尼曼匹克C1型类似蛋白(Niemann-Pick C1-Like 1,NPC1L1)目前被认为是胆固醇和植物固醇吸收的关键蛋白。在人体主要表达于小肠和肝脏,人饮食胆固醇70%左右通过NPC1L1蛋白吸收。胆固醇代谢中的关键酶DHCR24、重要转运蛋白npc1l1在结直肠癌中的表达及对血管生成的影响尚无报道。本研究就胆固醇合成酶dhcr24、转运蛋白npc1l1在结直肠癌中的表达及其对血管生成的作用进行了相关的研究及分析。材料和方法:1.检测人结直肠癌组织标本中dhcr24的表达并统计其表达与临床参数的关系。2.建立结直肠癌hct-116、sw480细胞dhcr24缺失的细胞系,并检测其条件上清对内皮细胞侵袭、成管能力的影响。3.采用免疫组化、qrt-pcr、wb等技术检测人结直肠癌组织标本和细胞系中的npc1l1的表达及与血管标志物cd31的相关性。4.建立结直肠癌hct-116、sw480细胞npc1l1缺失的细胞系,并检测其条件上清对内皮细胞增殖、侵袭、迁移、成管能力的影响。5.使用干扰npc1l1的结直肠癌细胞hct-116细胞系建立小鼠皮下移植瘤模型;并采用免疫组化、免疫荧光技术检测皮下移植瘤中cd31、vegfr2、ng2、collagenⅣ的表达。6.采用elisa方法检测结直肠癌细胞hct-116、sw480对照及npc1l1敲低组条件上清中各种血管生成因子的改变;使用wb技术检测结直肠癌细胞hct-116、sw480对照及npc1l1敲低组条件上清处理过的huvec细胞中vegfr2、p-vegfr2、erk、p-erk、akt、p-akt蛋白表达的改变。在条件上清中加入贝伐单抗后观察其对内皮细胞小管形成及侵袭能力的影响。结果:1.结直肠癌组织中dhcr24蛋白阳性表达于胞质,结直肠癌组织中dhcr24表达上调与患者临床分期、病理分化程度、淋巴结转移、生存预后相关,dhcr24高表达的结直肠癌患者预后较低表达组差,dhcr24的表达可以与分化程度及临床分期共同做为临床预后指标。2.(1)成功建立hct-116、sw480两个结直肠癌细胞dhcr24缺失的细胞系(2)dhcr24敲低组hct-116dhcr24kd、sw480dhcr24kd细胞系的条件培养上清促进内皮细胞侵袭、成管能力强与对照组细胞的差异无统计学意义。3.(1)结直肠癌组织中npc1l1的表达低于癌旁肠粘膜组织,并且npc1l1低表达提示差的临床预后;(2)正常肠上皮细胞系中npc1l1蛋白及rna水平的表达高于结直肠癌细胞系;(3)人结直肠癌石蜡组织连续切片中cd31和npc1l1的表达呈现负相关的关系。4.(1)成功建立HCT-116、SW480两个结直肠癌细胞NPC1L1缺失系的细胞系(2)NPC1L1敲低组HCT-116NPC1L1KD、SW480KD细胞系的条件培养上清促进内皮细胞增殖、侵袭、迁移、成管能力强于对照组细胞。5.(1)免疫组化技术染色发现NPC1L1敲低组HCT-116NPC1L1KD结直肠癌细胞系所建立的小鼠皮下移植瘤中CD31的表达高于对照组;(2)免疫组化及免疫荧光技术染色发现NPC1L1敲低组组所建立的小鼠皮下移植瘤中CD31、VEGFR2的表达高于对照组,而NG2、CollagenⅣ的表达低于对照组。6.(1)发现NPC1L1敲低组HCT-116 NPC1L1KD、SW480 NPC1L1KD细胞系条件上清中VEGF-A浓度高于对照组;(2)NPC1L1敲低组HCT-116NPC1L1KD、SW480NPC1L1KD细胞系条件上清处理过的HUVEC细胞中p-VEGFR2、p-ERK、p-AKT蛋白的表达高于对照组,而VEGFR2、ERK、AKT表达无显著差异。贝伐单抗可回复NPC1L1缺失所造成的内皮细胞成管及侵袭能力的增强。结论1.DHCR24在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁肠黏膜,DHCR24的表达可以与分化程度及临床分期共同做为临床预后指标;结直肠癌细胞中DHCR24缺失对进内皮细胞的侵袭、成管能力无影响。2.结直肠癌中NPC1L1的表达低于癌旁肠粘膜组织,结直肠癌组织中NPC1L1低表达提示差的临床预后,并且NPC1L1的表达与微血管密度呈负相关。体内外实验证实NPC1L1缺失可诱导结直肠癌的血管生成。3.结直肠癌NPC1L1缺失增加上清中VEGF-A的分泌来促进血管生成。使用贝伐单抗可回复NPC1L1缺失引起的结直肠癌血管生成。