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瑟氏泰勒虫病是瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内的血液原虫病,以长角血蜱为传播媒介。牛感染此虫体后在临床上表现出高稽留热、贫血、消瘦、出血以及体表淋巴结肿大等症状。该病可影响母牛产后的出奶量及降低出生小牛的存活率,主要分布在东北亚地区,危害十分严重,给养牛业带来严重的经济损失。近几年,随着全球经济迅速发展,养牛业逐渐扩大,瑟氏泰勒虫病的流行区也随之扩大,给各地区以及全国的畜牧业带来不可挽回的经济损失,引起兽医界的广泛关注。因此,监控、防治和检测瑟氏泰勒虫病,降低其发病率是当务之急。为此,本试验建立了一种简便、特异、敏感的瑟氏泰勒虫PCR-ELISA检测方法,为瑟氏泰勒虫病流行病学调查及诊断提供手段。首先根据Genbank上发布的瑟氏泰勒虫基因序列[DQ078264.1]设计两对相同序列引物,并在其中一对引物上下游5’端分别标记上生物素(Biot)及地高辛(Dig),合成一对标有非放射性物引物。从PCR检测为瑟氏泰勒虫病阳性抗凝血中提取基因组DNA,进行常规PCR,获得该病的目的基因片段,纯化回收后,将其克隆到pMD-19T simple载体,进行质粒PCR及双酶切鉴定,确定阳性结果后送往生物公司进行测序,完成基因检测。根据PCR-ELISA方法基本步骤,对链酶亲和素浓度、封闭时间、PCR产物稀释度、HRP-抗地高辛抗体的稀释度及显色时间等进行优化,确定反应的最佳条件。选取40份经PCR检测确定为瑟氏泰勒虫阴性样本进行PCR-ELISA检测,测定OD450nm值,按照公式x+3SD计算瑟氏泰勒虫病PCR-ELISA方法的临界值,确定判定标准。将瑟氏泰勒虫基因组DNA进行倍比稀释,PCR-ELISA方法测定,确定敏感性。以牛弓形虫、新孢子虫、环形泰勒虫等基因组DNA为模板在最佳反应条件下检测该方法的特异性。通过对同一时间包被酶标板的重复性试验和不同时间包被酶标板的重复性实验来检测此种方法的稳定性。取112份待检牛抗凝血进行检测,与常规PCR法进行比较,确定该方法在临床上的应用。结果表明,常规PCR检测后条带大小约为421 bp,与Genbank上发布的瑟氏泰勒虫基因序列[DQ078264.1]的同源性达到99%,证明扩增的目的片段为瑟氏泰勒虫。对各个试验环节进行优化,得出链酶亲和素浓度为5 μg/mL, HRP标记抗地高辛抗体稀释2000倍,封闭时间为60 min, PCR产物稀释30倍,底物显色15 mmin时,为最适的反应条件。检测40份经PCR检测确定为瑟氏泰勒虫阴性样本得出临界值为0.174,样本OD450nm值大于0.174的为瑟氏泰勒虫阳性,反之为阴性PCR-ELISA方法测出瑟氏泰勒虫DNA最低浓度为18fg/μL,较常规PCR法检测出的18fg/μL,敏感性高10倍,且与牛弓形虫、新孢子虫、环形泰勒虫等之间无交叉反应,具有较强的特异性。对112份待检牛抗凝血进行检测,阳性检出率为34.8%,高于常规PCR法的28.6%。本试验建立一种特异、敏感、安全、省时的瑟氏泰勒虫快速检测方法,可适用于瑟氏泰勒虫病的诊断和流行病调查。