论文部分内容阅读
目的:
构建RU486调控系统介导的重组腺病毒Ad-RUNRF2,并在H460细胞中进行表达,验证NRF2基因表达是否可调控及表达效率。观察Ad-RUNRF2腺病毒对百草枯(PQ)所致A549细胞损伤及对大鼠百草枯中毒性肺损伤的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB-1表达的干预作用。
方法:
1.在腺病毒载体的基础上,引入携带RU486(米非司酮)诱导调控系统的NRF2基因;用LUC基因及Dsred基因对RU486调控系统进行验证,并通过Westernblot和RT-PCR技术检测NRF2的表达情况。
2.重组腺病毒Ad-RUNRF2成功转染A549细胞,以EMSA、Real-timePCR观察在RU486给予后6、12、24、48hNRF2蛋白及基因表达情况,WesternBlot、ELISA、Real-timePCR检测不同浓度(0、10-9、10-8、10-7mol/L)RU486(米非司酮)诱导及在PQ暴露的不同时间(PQ暴露前6h、PQ暴露后0、6、12h)用RU486进行诱导后,NRF2表达对百草枯致A549细胞损伤炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α蛋白、基因表达。
3.重组腺病毒Ad-RUNRF2转染大鼠肺组织后,以不同剂量RU486诱导(Oug/kg、125ug/kg、250ug/kg、500ug/kg)及不同时间诱导(中毒前诱导、中毒后48h诱导),通过EMSA及Real-timePCR检测U486诱导后NRF2蛋白及基因的表达量,并通过ELISA及Real-TimePCR检测各组大鼠血浆IL-6、IL-10、TNF-α、HMGB1蛋白表达量及肺组织各指标的mRNA表达情况。
结果:
1.LUC和DSred的表达都随RU486呈剂量依赖性增加;Ad-RUNRF2腺病毒感染H460细胞后,通过RT-PCR及WesternBlot结果显示NRF2的表达量随着RU486剂量的增加而增加,去除RU486后,NRF2的表达也随之减弱。NRF2的变化随时间的变化而变化,其中以12小时表达量最高(P<0.05)。
2.NRF2表达随着RU486增加而增加,以10-7mol/L时最强,1L-6、TNF-α的表达与RU486诱导量呈反比,在10-7mol/L时表达量最低(P<0.05),而IL-10的表达则相反。NRF2表达在PQ暴露前6h诱导表达量最高,与对照组及其他时间点表达有显著性差异(P<0.01),有RU486诱导组NRF2表达与对照组相比均有显著性差异(P<0.01),PQ暴露0、6、12h诱导NRF2表达量逐渐上升。不同时间点RU486诱导对IL-6、L-10、TNF-α蛋白、基因表达亦有影响,其中PQ暴露0小时时,效果最佳,与对照组相比有明显治疗效果(P<0.05)。
3.动物实验结果Nrf2基因及蛋白在RU486调控下,随着RU486浓度的增加而增加,在无RU486诱导时Ad-RUNRF2腺病毒转染的大鼠肺组织仍有一定数量的Nrf2基因及蛋白表达。不同的时间诱导时,与PQ中毒对照组及空白组相比,提前诱导组及治疗组基因及蛋白表达显著性增加(P<0.01),但两组之间则无显著性差异(P>0.05)。RU486诱导组TNF-α、IL-6、IL-10、HMGB-1表达与无RU486诱导组有显著性差异(P<0.05),其中250ug/kg剂量RU486诱导时抗炎及促炎表达更为平衡;诱导时间对炎症因子的表达无显著性影响,但与PQ中毒对照组比有显著性差异(P<0.05)。
结论:
携带RU486可调控式NRF2基因腺病毒构建成功,并且在细胞内RU486能够调节NRF2因子的表达。重组腺病毒Ad-RUNRF2在不同浓度RU486调节NRF2表达,对炎症因子表达有调节作用。RU486在PQ中毒时同时诱导,效果最好,认为Ad-RUNRF2可以减轻A549细胞中由百草枯引起的炎症反应。不同浓度RU486诱导对大鼠百草枯急性肺损伤时炎症因子表达有显著干预作用,而诱导时间对炎症因子表达则无明显影响。