目的：　　肝细胞癌(HCC)的发病率在人类恶性的肿瘤中排名第5位，是人类最常见的癌症之一，而在中国人群中HCC在恶性肿瘤的发病率达到了第3位，每年新增原发性肝细胞癌病例有近600000例。原发性肝细胞癌恶性程度高，使其成为肿瘤相关死亡的第三大原因。在过去的二十年，原发性肝细胞癌患者的总体生存率并没有得到显著改善，目前应用于临床的治疗手段包括外科手术切除及肝脏移植，这些治疗通常大多只适用于肿瘤的早期阶段，因原发性肝细胞癌临床侵袭及转移率高，大多数患者被检出疾病时已处于晚期阶段或存在有不可切除的疾病表现使其预后惨淡。因传统的全身化疗对这类病人会产生严重的不良的反应，对于这些检查出疾病时就已没有了手术机会或有些进行了肝癌手术治疗后复发或发生远处转移的患者，截止现在在临床上还没有比较理想的治疗手段，使得这类肝癌患者目前仍然只有较低的3年存活率。由此可以看出，肝癌治疗的关键环节在于能够有效地阻止肿瘤细胞向周围浸润及远处转移的能力，深入地对肝癌细胞周围浸润及远处转移的关键分子进行研究具有可观的临床价值和科学意义。　　目前肝细胞癌的转移机制仍不是很明确，现存的肿瘤发生发展机制，如基因突变理论（包括染色体数目及染色体结果等）及外界的理化致癌因素等，截至目前都还不能够比较理想的阐明肝细胞癌在其细胞发生增殖、分化、侵袭、远处转移或者肝癌复发时的相关分子机制。目前有文献报道，不同的肿瘤细胞具有不同的细胞特性，在不同肝癌细胞中，各自在细胞的基因学特性或者分子生物学特性方面存在显著的差异，从而引起肿瘤在生长、肿瘤细胞侵袭转移能力及其对药物敏感性等多个方面产生差异。肿瘤细胞在形态结构、功能及抗原免疫等方面的差异性是肿瘤在异质性上的几种表现形式。肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一，因此，针对肝癌细胞的这一特点，可以对不同种类的肝癌细胞进行分子水平的基础研究，以便为探索肝细胞癌在基础或临床生物学行为上的多样性提供更多的实验依据。研究显示，肿瘤细胞的侵袭转移能力并不是肿瘤细胞群中所有的肿瘤细胞均具有的特性，而是仅有少部分细胞所具有的特性。因此猜测：这些少数具有侵袭转移能力特性的肝癌细胞是否表现出某些调控蛋白的异常转录和表达，并通过调控相关蛋白的表达，使得这些细胞获得较强的侵袭转移能力或抵抗化疗药物的能力，从而发生肿瘤细胞的侵袭转移。　　Hedgehog(Hh)信号通路基因最初被发现是在30年前作为控制果蝇胚胎角质层的一个“节段性”基因。自1990年代早期在脊椎动物中发现Hh信号通路以来，人们在揭示它从发展和致病以及其分子基础级联信号中取得了巨大的进步。研究发现，Hh信号通路在生物胚胎发育和包括细胞增殖、分化的各种细胞功能的监管以及维持生物体稳态中扮演着一个重要角色。三种Hedgehog同源基因存在于哺乳动物体内：它们分别是Sonic Hedgehog(SHH)、Desert Hedgehog(DHH)以及Indian Hedgehog(IHH)。两种靶细胞膜上的受体Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)共同调控着Hh信号的传递。Hh信号通路的关键转录因子Gli家族（由Gli1、Gli2和Gli3三个成员组成）在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。在未被激活的Hh信号通路中，gli家族的三个成员都不能入核，从而不能行使其转录调控的功能。已有文献显示Gli1可以调节下游靶基因（包括侵袭转移相关靶基因）的表达。研究报道多种肿瘤的发生都有Hh信号通路的参与，包括基底细胞癌、食道癌、胃癌、视网膜母细胞瘤、胰腺癌等。另外也有文献显示，异常激活的Hh信号通路参与了肝细胞癌的发生发展以及侵袭转移。但其参与肝癌细胞发生侵袭转移的分子机制尚不清。　　上皮细胞间质转化(Epithelial-mesenchymal transition EMT)是上皮细胞在某些因素刺激下向间质细胞转化的过程，它赋予细胞侵袭转移的能力，包括干细胞特性、减少细胞凋亡及增强免疫抑制等，其不仅影响细胞的发育过程，还参与组织愈合、器官纤维化及癌症发生发展等过程。当EMT发生在肿瘤细胞中时，可以看作肿瘤细胞侵袭转移的开始。当肿瘤细胞发生EMT时可以出现以下几个特征性变化：上皮细胞的标志E-cadherin下调、间质细胞的标志N-cadherin、vimentin上调等。E-cadherin对维持细胞形态、细胞运动及粘附能力具有非常重要的作用，在某些生理或病理刺激的情况下，当E-cadherin在肿瘤细胞中的表达降低时，导致细胞之间的粘连附着能力随之下降，从而导致原发病灶中的肿瘤细胞发生脱落，进而向周围组织侵犯或向远处转移。已有研究发现，在肿瘤细胞发生EMT过程中，其关键调控转录因子Twist1的mRNA和蛋白水平均明显增高。于是推测：在Hh信号通路异常激活的各类肝癌细胞中，Twist1蛋白可能是调控细胞发生EMT进而向远处转移的重要分子基础。　　本课题拟通过对Hh信号通路中的关键转录因子Gli1在肝癌细胞侵袭转移中作用的研究，探索其主要的分子机制，为评估肝癌复发、转移及预后提供可能的实验依据，为以后对肝癌治疗的基础或临床研究提供可能的新的思路。　　方法：　　1.采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)在Huh7、hepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五种人肝癌细胞中筛选出Gli1蛋白高表达和Gli1蛋白低表达的细胞系。　　2.构建Gli1表达载体pLentis-PGK-GTP-SFFV-GLI1，并制备为病毒Lentiviral-Gli1;将制备出的Lentiviral-Gli1感染到筛选出的高表达Gli1蛋白的人肝癌细胞中，为Lentiviral-Gli1组，而空白对照组（N组）不做任何处理，空载对照组(NC组)仅转染空载体。　　3.根据GenBank数据库设计并合成3条Gli1-siRNA经质粒转染到筛选出的高表达Gli1蛋白的人肝癌细胞中，分别为pGCsi-U6-GLi siRNA-1(siRNA-1组)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-2(siRNA-2组)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-3（siRNA-3组），而空白对照组（N组）不转染任何序列，阴性对照组转染阴性对照序列(NC组)。　　4.采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blotting检测筛选出的Lentiviral-Gli1组及转染了Gli1-siRNA48小时后各组Gli1-mRNA和Gli1蛋白相对表达水平，并筛选出最佳siRNA序列。　　5.采用细胞划痕实验观察Lentiviral-Gli1组及筛选出的最佳siRNA序列组的细胞的迁移能力，并应用Western blotting分别检测各组细胞中上皮间质转化的相关蛋白Twist1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的表达。　　结果：　　1.Western blotting检测结果提示，与Huh7、hepG2、PLC及SMMC-7721四种人肝癌细胞相比较，Bel-7404细胞中Gli1相对蛋白水平表达增加(P均＜0.05）;hepG2、PLC、SMMC-7721及Bel-7404四种人肝癌细胞比较，Huh7细胞中Gli1相对蛋白水平表达降低（P值均＜0.05）。　　2.在筛选出的低表达Gli1蛋白的Huh7细胞中，与N组、Lentiviral-Control组细胞相比较，Lentiviral-Gli1组中细胞的Gli1蛋白水平及Gli1mRNA水平相对表达量均最高（P值均＜0.05）;且Lentiviral-Gli1组中的Twist1蛋白水平表达上调，E-cadherin蛋白水平表达下调，N-Cadherin和Vimentin蛋白水平表达上调，细胞迁移能力升高（P值均＜0.05）。　　3.在筛选出的高表达Gli1蛋白的Bel-7404细胞中，与siRNA-1组、siRNA-3组、N组及NC组细胞相比较，siRNA-2组中细胞的Gli1蛋白水平及Gli1mRNA水平相对表达量均最低（P值均＜0.05）。　　4.与N组比较，siRNA-2组细胞中的Twist1蛋白水平表达下调，E-cadherin蛋白水平表达上调，N-Cadherin和Vimentin蛋白水平表达下调，细胞迁移能力下降（P值均＜0.05）。　　结论：　　1.Huh7、hepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五种人肝癌细胞中，Bel-7404细胞中Gli1蛋白相对表达量增加，Huh7细胞中Gli1蛋白相对表达量降低。　　2.使用siRNA干扰人肝癌Bel-7404细胞Hh信号通路中的关键转录蛋白Gli1表达水平可下调细胞中的Twist1蛋白水平的表达，并且可抑制EMT及细胞的迁移能力。　　3.使用Gli1表达载体pLentis-PGK-GTP-SFFV-GLI1经病毒过表达人肝癌Huh7细胞Hh信号通路中的关键转录蛋白Gli1可上调细胞中Twist1蛋白水平的表达，并且可促进EMT及增强细胞的迁移能力。