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目的1.应用3T3-L1脂肪细胞体外培养体系,探讨克伦特罗(clenbuterol, CLB),莱克多巴胺(ractopamine, RAC)和齐帕特罗(zilpaterol, ZIL)对脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptor γ, PPARγ)及脂联素(adiponectin, ADP)表达的影响及差异,阐明CLB, RAC, ZIL引起脂肪细胞内分泌紊乱的分子机制,以及三者对脂肪内分泌紊乱相关性生殖疾病潜在的影响。2.建立脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养模型,探讨成熟脂肪细胞对睾丸间质细胞胰岛素样因子(Insulin-like factor, INSL3)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)的表达效应,有助于阐明肥胖诱导男性不育症的分子机制。3.建立脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养模型,探讨CLB对共培养体系中睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD表达的影响,阐明CLB在脂肪内分泌紊乱相关性男性生殖疾病中可能介导的环节。材料与方法1.材料1.1 3T3-L1脂肪细胞3T3-L1前脂肪细胞株购自于中国科学院上海细胞库,定向诱导为3T3-L1成熟脂肪细胞后进行实验。1.2 TM3睾丸间质细胞TM3睾丸间质细胞由暨南大学禹艳红老师惠赠,培养传代后可进行实验。2.实验分组及给药2.1 3T3-L1脂肪细胞分组及给药本项实验添加不同剂量的药物培养12h,24h后分别收集细胞,进行细胞活性与PPARγ及ADP表达水平的检测。本项实验分组见表1。2.2共培养体系分组及给药将睾丸间质细胞分别与成熟脂肪细胞,添加5μM CLB处理的成熟脂肪细胞共培养48小时,分别标记为脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组,CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组；另添加5μM CLB处理睾丸间质细胞单独培养,标记为CLB处理睾丸间质细胞实验组；将单独培养的睾丸间质细胞设为对照组。3.实验方法3.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导及鉴定3T3-L1前脂肪细胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养液在37℃,5%CO2条件培养。待细胞贴壁,生长至接触抑制后2天进行成脂诱导分化,更换含有0.5mM IBMX、10μg/ml胰岛素和1μM地塞米松的诱导剂及10% FBS的DMEM高糖培养液。2天后,更换只含10μg/ml胰岛素及10%FBS的培养液继续培养,每2天换液1次。8-10天后,90%的细胞内出现脂滴,可用于后续实验。油红O染色鉴定成熟脂肪细胞。3.2 TM3睾丸间质细胞的培养TM3睾丸间质细胞用含10%马血清的DMEM/F12培养液,在37℃,5% C02培养箱培养,每2天换液1次,直至细胞融合达80%以上,可进行传代。3.3共培养体系的建立采用Transwell系统进行3T3-L1脂肪细胞和TM3睾丸间质细胞共培养。3T3-L1脂肪细胞种入6孔培养板,经诱导后,在Transwell小室种入TM3睾丸间质细胞。在37℃,5% CO2培养箱中培养48小时。3.4 3T3-L1脂肪细胞活性检测MTT分别检测不同剂量CLB, RAC,ZIL对3T3-L1脂肪细胞活性的影响。3.5脂肪因子PPARγ及ADP,睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD的表达RT-PCR和Western blot检测脂肪因子PPARγ、ADP,睾丸间质细胞INSL3、 3β-HSD表达水平的变化。4.统计学方法数据以平均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS21.0统计学软件进行分析。采用单因素方差分析(ANOVA),有统计学意义则用Tukey法作组间均数的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.3T3-L1脂肪细胞诱导及鉴定3T3-L1前脂肪细胞生长接触抑制后,经诱导8-10天,3T3-L1前脂肪细胞可分化为成熟脂肪细胞。并经油红O染色鉴定,大约90%的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。2. CLB,ZIL,RAC对3T3-L1脂肪细胞活性的影响及差异与对照组相比,CLB,RAC,ZIL分别处理12h和24h后各剂量组细胞活性均呈下降趋势,剂量越大,活性影响越大,差异显著(P<0.05)。培养12h,细胞活性：B组<B1组<B2组,但组间无显著差异(P>0.05)；C组<C1组<C2组,组间无显著差异(P>0.05),C组<C2组(P<0.05)；D组<D2组(P<0.05),D1组<D2组(P<0.05),D组<D1组(P>0.05)。培养24h,B组<B1组<B2组,C组<C1组,C1组<C2组,组间均无显著差异(P>0.05)；C组<C2组,D组<D1组<D2组,组间差异显著(P<0.05)。3. CLB,ZIL,RAC对3T3-L1脂肪细胞PPARy及ADP表达的影响及差异CLB,RAC, ZIL对PPARγ、ADP的表达影响基本呈一致性。CLB, RAC, ZIL均下调PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表达水平,且表达水平从高到低的顺序为：低剂量组,中剂量组,高剂量组(P<0.05)。培养12h,PPARγ的表达水平：B组<B1组(P<0.05),B组<B2组(P<0.05)；B1组<B2组,无显著差异(P>0.05)；C组<C1组<C2组,D组<D1组<D2组,组间差异显著(P<0.05)。培养24h,C组<C1组<C2组,D组<D1组<D2组,组间差异显著(P<0.05)。培养12h,ADP的表达水平：B组<B1组<B2组,C组<C1组<C2组,组间无显著差异(P>0.05)；D组<D1组<D2组(P<0.05)。培养24h,B组<B2组(P<0.05),B组<B1组(P>0.05),B1组<B2组(P>0.05);C组<C2组,C1组<C2组,D组<D2组,D1组<D2组,组间差异显著(P<0.05)；C组<C1组,D组<D1组,无显著差异(P>0.05)。4.脂肪细胞共培养及CLB对睾丸间质细胞INSL3及3β-HSD表达的影响与睾丸间质细胞单独培养对照组对比,CLB处理睾丸间质细胞组INSL3表达下降,但无显著差异(P>0.05),脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组INSL3表达下降(P<0.05)；CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组INSL3下降程度更大(P<0.05)。与睾丸间质细胞单独培养对照组对比,CLB处理睾丸间质细胞组3p-HSD表达升高,但无显著差异(P>0.05)；脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组3β-HSD表达下降(P<0.05); CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组3p-HSD下降程度更大(P<0.05)。结论1. CLB, ZIL, RAC按影响程度从大至小依次降低脂肪细胞活性,下调PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表达水平,并呈剂量依赖性,提示CLB,ZIL, RAC影响PPARγ和ADP的合成,可导致脂肪细胞内分泌紊乱,从而可能引起脂肪内分泌紊乱相关性生殖活动。2.β2AR激动剂对脂肪细胞内分泌功能的效应与激动剂种类相关,CLB,ZIL, RAC这3种激动剂对脂肪细胞产生效应不同,其中CLB影响最大,ZIL次之,RAC影响较小。3.与脂肪细胞共培养下,睾丸间质细胞INSL3与3β-HSD的表达下降可能是肥胖引发男性生殖疾病的重要机制；CLB与脂肪细胞共同作用下,3β-HSD与INSL3表达下降程度更大,CLB相关的脂肪细胞内分泌紊乱可能引起男性生殖系统异常。