目的 砷是一种广泛存在于自然界的元素。砷化合物种类繁多，主要包括无机砷(三价和五价)及有机砷(甲基砷和二甲基砷)。无机砷进入体内在肝脏发生生物转化的基本过程为：无机五价砷(As~Ⅴ)—还原→无机三价砷(As~Ⅲ)—甲基化→甲基砷酸(MMA~Ⅴ)—还原→甲基亚砷酸(MMA~Ⅲ)—甲基化→二甲基砷酸(DMA~Ⅴ)—→还原→二甲基亚砷酸(DMA~Ⅲ)。砷酸盐还原酶、甲基砷酸盐还原酶、二甲基砷酸盐还原酶、亚砷酸盐甲基转移酶、甲基亚砷酸盐甲基转移酶、还原型谷胱甘肽(GSH)及S-腺苷甲硫胺酸(SAM)参与此过程。过去认为，对人体造成危害的主要是三价无机砷，砷在体内的代谢过程是其解毒过程。但目前的研究表明，砷在代谢过程中产生的各种中间代谢产物对机体亦具有毒作用。据报道MMA~Ⅲ具有比无机砷更强的毒性，活性极强的MMA~Ⅲ及DMA~Ⅲ可能是砷化合物中诱发砷性癌症的主要物质。砷的甲基化过程与原癌基因的激活及抑癌基因的失活关系密切。砷代谢过程中可产生活性氧自由基(ROS)，攻击DNA，造成DNA单、双链断裂，DNA-蛋白质交联以及DNA的碱性易损伤位点，即无嘌呤无嘧啶位点(AP)的形成。大量流行病学调查资料表明，砷对于人类是一种确定致癌物，砷暴露人群中肺癌、皮肤癌显著高发。砷与DNA损伤之间关系的研究现已成为砷研究领域中的热点问题。 单细胞凝胶电泳技术(又称慧星试验)是一种目前广泛应用于单细胞DNA损伤的检测技术。其主要原理为：细胞在裂解液的作用下膜结构被破坏，细胞内成份扩散到裂解液中。DNA由于相对分子量大而被留在原位。在碱性条件下，DNA发生解旋，其中的断裂片断和碱性易损伤片断被释放出来。在电场中泳动时，这些片断可从核内溢出，形成与细胞核“头部”相区别的“尾部”。用荧光染料标记后，在荧光显微镜下可呈慧星样外观。在一定范围内，慧星的长度或荧光强度与DNA的损伤程度相关。该法快速。灵敏、简便易行。广泛应用于DNA的损伤与修复，DNA一蛋白质交联及DNA链间交联，遗传毒理学，肿瘤学，生物监测以及流行病学等多个研究领域。 本研究即是以慧星试验为检测手段，研究三种砷化合物对健康人淋巴细胞DNA的损伤效应，即DNA链的断裂效应间是否存在作用差异，并初步探讨砷化合物作用下诱导DNA链发生断裂的机理。 方 法 1．淋巴细胞分离： 无菌抽取健康人静脉血20rnl与等量RPMll640培养基混合，缓慢加至等量淋巴细胞分离液上层。离，L’ （3000r／mi，30min，4T）后吸取中间的淋巴细胞层，以 RPMll640洗二次后门000r／dn，10min，4T）再以含10％小牛血清的RPMll640培养基调细胞悬液体积为16Inl。将细胞悬液加于24孔培养板，每孔IInl，共加16孔。送至二氧化碳培养箱培养门7t，5％CO。人待细胞稳定30min后开始施加处理因素，即 As“‘，As”及 MAs”。每种处理因素均分 5个剂量组：＼5，10，20及 50 pmol／L。每个因素每个剂量做1孔，每孔加药量为 20…，同时设 1孔空白对照组门 20 pl生理盐水人培养24小时后将每孔细胞悬液吸出，以胎盘兰法计算细胞活力后将细胞悬液离心（1000r／nd，10min，4℃人将淋巴细胞以PBS洗2次门000r／ndn，10min，4T）中止反应后以 PBS调细胞悬液终体积为 200pl。 ·2· 2．慧星实验： 玻片预处理：二％普通熔点琼脂糖（NMA乃0 pl涂片，酒精灯上迅速烤干。 第一层凝胶：l％NMA 100gi滴于经过预处理的玻片，盖片，将玻片置于冰排上，胶面向上，送4℃冰箱内固化10drin。 第二层凝胶：取已制备好的细胞悬液 200 pl，加 1％低熔点琼脂糖（LMA厂 则（预先保存在37℃水浴中人混匀，从中取85 pl滴于已固化的第一层凝胶上，盖片。对照组及三种处理因素的每个剂量组均做2个平行样。4qC冰箱内固化＊。 第三层凝胶：l％LMA 85gi滴于第二层凝胶上，盖片，4T冰箱内固化10min。 取下第三层盖片后立即将玻片浸人细胞裂解液中，在4℃冰箱内裂解90min。取出玻片用滤纸擦干，在电泳液中浸泡30min使DNA解旋后将玻片平铺于水平电泳槽（胶面向上L电泳20min（电流300InA，电压25V人上述全部操作均需保持在4℃、暗光条件下进行，以避免DNA发生额外损伤。电泳结束后将玻片取出，滤纸擦干，用 0．4moUL Tis中和 3次，每次smin。 用滤纸将玻片擦干后以 40… 化乙锭门0mg／L）染色，加盖片后在荧光显微镜（G激发厂下观察。对照组及三种处理因素的每个剂量组均计数两张片子，每张片子计数50个细胞，即：对照组及三种处理因素的每个剂量组均计数 100个淋巴细胞。用目镜测微尺以单盲法测定每个细胞的总慧星长度（卜叫。以观测到的总慧星长度的最小值及最大值为依据，按极差大小将全部观测值分为五个组段，每个组段代表DhM损伤程度的一个级别（用罗马数字1，11，Ill，IVJ表示X随着细胞级别的增大，总慧星长度增大，DNA损伤程度增大。用SuPeria X－’fRA ISO400胶卷，以 NIKON－UFX 11型成像装置?