缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是由多种原因引起的脑组织缺血缺氧所导致的脑部病变。该病在任何年龄阶段均可发生,由于缺血缺氧性脑病能够引起神经元的死亡和神经功能缺失,导致不良预后,因此是神经系统疾病防治的重点之一。以往的研究发现缺血缺氧所导致的脑损伤程度因神经元成熟度的不同而有所区别,未发育成熟的大脑比成熟的大脑对缺血缺氧损伤的抵抗能力更强,然而其潜在的机制仍不明确的。所以,探讨不同发育程度的大脑在缺血缺氧损伤后应激反应的区别对提高缺血缺氧性脑病的治疗效果具有积极的意义。在本研究中,我们从缺血缺氧脑损伤后的热休克反应入手,主要进行了两部分实验,在实验的第一部分,我们探讨了缺血缺氧性脑损伤后分子伴侣在不同发育阶段脑组织中的差异性表达,以及未成熟和成熟脑在缺血缺氧损伤后HSF1在不同亚细胞机构中的差异性表达;在实验的第二部分,我们探讨了在非应激状态下,分子伴侣在不同发育阶段大脑中的原始表达水平。通过该项研究,进一步揭示了缺血缺氧性脑损伤的发病机制,为成人和新生儿在缺血缺氧损伤后治疗的不同靶点提供研究基础和理论依据。第一部分缺血缺氧性脑损伤后分子伴侣和HSF1发育依赖性表达的研究目的:探讨缺血缺氧损伤后不同发育程度大脑中分子伴侣和HSF1的差异性表达。方法:(1)分别选取P7(出生后7天)和P26(出生后26天)Sprague-Dawley大鼠,采用Rice-Vannucci法建立缺血缺氧脑损伤的动物模型。于麻醉下结扎左侧颈总动脉,术后恢复1小时,将实验动物置于37℃恒温水浴缺氧舱中,输入氧浓度为8%的氮氧混合气体,P7组动物缺氧时间为1h,P26组动物缺氧时间为30min,以保证两组实验动物缺氧损伤程度的一致性。然后将实验动物置于常温空气状态恢复。分别选择缺血缺氧后30min,4h和24h留取样本进行实验分析。(2)对P7组和P26组不同恢复时间的脑组织采用原位杂交技术分别检测HSP70、HSP60、GRP78的m RNA表达。(3)分别提取P7组和P26组不同恢复时间点的脑组织蛋白质,采用免疫印迹法对HSP70、HSP60、GRP78的蛋白质表达进行检测分析。(4)分别分离P7组和P26组不同恢复时间点的脑组织亚细胞结构,采用免疫印迹法对HSF1蛋白质的差异性表达和核转位进行检测分析。(5)采用共聚焦显微镜观察P7组和P26组HI后不同恢复时间的脑组织HSP70和HSF1的免疫组织化学荧光表达。结果:(1)在缺血缺氧性脑损伤后,P26缺血缺氧组和P7缺血缺氧组HSP70 m RNA的表达增高主要发生在损伤大脑半球同侧的整个皮层,纹状体、海马和部分皮层下区域;在P26缺血缺氧组,HSP70 m RNA在HI后的30min表达开始增高,4h时达到高峰,24h时HSP70m RNA水平仍较对照组升高,但较缺血缺氧性脑损伤后4h有所下降。缺血缺氧性脑损伤后P7缺血缺氧组HSP70 m RNA的表达模式与P26缺血缺氧组相似,但与P26缺血缺氧组相比,缺血缺氧性脑损伤后HSP70 m RNA在P26大脑样本中增高显著,P7缺血缺氧组与P26缺血缺氧组组间比较差异有显著性。在缺血缺氧脑损伤后,P26缺血缺氧组HSP60m RNA表达水平在缺血缺氧损伤后30min开始升高,4h和24h均持续增加。但在P7缺血缺氧组,HSP60m RNA的表达与对照组相比变化不明显;在缺血缺氧脑损伤后,GRP78在P26缺血缺氧组和P7缺血缺氧组中的变化与HSP60m RNA大致相同,均没有HSP70m RNA的表达增加显著。(2)在缺血缺氧脑损伤后,P26缺血缺氧组大脑样本中HSP70蛋白的在损伤后4h和24h表达明显增加,但P7缺血缺氧组中只在损伤后24h有极微弱的增加。HSP60蛋白和GRP78的蛋白表达在缺血缺氧脑损伤后没有明显变化。(3)在缺血缺氧脑损伤后,P26缺血缺氧组HSF1蛋白表达并进行了重新分配,在缺血缺氧损伤后的30min、4h和24h,HSF1从细胞浆结构(S3)向细胞核结构(P1)发生了转移。这种HSF1核转位的现象在P26缺血缺氧组更为显著。而在P7缺血缺氧组,HSF1的核转位现象并不明显,虽然在缺血缺氧损伤后的30min,细胞浆结构(S3)中的HSF1蛋白表达有所减少,但HSF1蛋白表在细胞核结构(P1)中却没有明显的增加。(4)在缺血缺氧脑损伤后的30min,P26缺血缺氧组HSF1蛋白免疫荧光表达在皮层、海马CA1和齿状核区域的细胞核内缓慢增加,在缺血缺氧损伤后的4h到24h表达稳定上升。与之相对应,在缺血缺氧脑损伤后,在P26缺血缺氧组HSP70蛋白免疫荧光表达在HI后的4h也发生了上调,但与HSF1相比,在皮质、海马CA1和齿状核区域细胞质内的表达增加相对延迟些。P7缺血缺氧组样本中HSF1蛋白免疫荧光表达水平和模式的变化并未发生在皮层、海马CA1和齿状核区域,即在损伤后的30min、4h和24h HSF1均未见明显变化。另外,通过进一步的研究发现,P7缺血缺氧组在缺血缺氧脑损伤后HSP70蛋白免疫荧光表达的微弱增加主要发生在小胶质细胞中。结论:(1)与未发育成熟的脑组织相比,在缺血缺氧脑损伤后,发育成熟的脑组织中细胞的热休克反应更加强烈,提示缺血缺氧脑损伤后发生的热休克反应呈发育依赖性。(2)与未成熟脑组织相比,在缺血缺氧脑损伤后4h,发育成熟的脑组织分子伴侣m RNA表达水平显著增加,尤其是在细胞浆中表达的HSP70更为明显。(3)与未成熟脑组织相比,在缺血缺氧脑损伤后24h,成熟脑组织HSP70蛋白质的表达水平显著增高,与HSP70 m RNA的上调反应时间相比较,HSP70蛋白表达上调是延迟的。提示这种蛋白质表达的延迟可能是成熟脑较未成熟脑对缺血缺氧损伤耐受差的原因之一。(4)与未成熟脑组织相比,在缺血缺氧脑损伤后,HSF1仅在成熟脑组织中发生了核转位,HSF1向细胞核转移,从而促进热休克蛋白的合成。第二部分不同发育程度大脑分子伴侣原始水平差异性的研究目的:探讨在非应激的正常状态下,不同发育程度的大脑分子伴侣原始水平的表达差异。方法:分别选取P7(出生后7天)和P26(出生后26天)Sprague-Dawley大鼠。液氮冷冻后匀浆提取脑组织蛋白,采用免疫印迹法对P7组和P26组脑组织中热休克因子HSF1和分子伴侣HSC70、HSP40、GRP78、GPR94、PDI和HSP60的原始水平进行检测分析。结果:(1)P26组脑组织样本中热休克因子HSF1的水平明显高于P7组。(2)在P7组和P26组脑组织样本中,位于细胞浆中的分子伴侣HSC70和HSP40的水平几乎相同。(3)位于内质网中的分子伴侣和折叠酶GRP78、GRP94和PDI的水平在P26组脑组织样本中要低于P7组。(4)位于线粒体基质的热休克蛋白HSP60的水平在P26组脑组织样本中要明显高于P7组。结论:(1)与未成熟脑组织相比,HSF1在成熟脑组织中的原始水平显著增高。(2)分子伴侣HSC70和HSP40的水平在成熟脑组织和未成熟脑组织中的原始水平几乎相同。(3)与未成熟脑组织相比,成熟脑组织中HSP60的原始水平显著增高。(4)与未成熟脑组织相比,成熟脑组织中GRP78、GRP94和PDI的原始水平明显降低。