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多发性硬化症(MS)是由自身反应性T细胞介导的,对髓鞘抗原免疫耐受破坏所致的自身免疫病。自身靶抗原通过与抗原提呈细胞结合触发自身致病性CD4+Th1/Th17细胞产生,同时伴有调节性T细胞(Tregs)的免疫功能抑制,可能与MS发病有关。T细胞在胸腺内的发育经阴性选择,自身反应性T细胞发生清除或抑制,可诱导抗原特异性耐受,阻止MS的发生和发展。胸腺功能减退和其内自身抗原的不稳定表达则影响了阴性选择发生而限制了治疗效果。因此,对MS的防治而言,耐受诱导不仅依赖于自身抗原在胸腺持续表达,而且还与胸腺功能是否正常有关。但随年龄增长,胸腺上皮细胞(TECs)凋亡,导致胸腺微环境的改变,胸腺功能逐渐退化,可引起T细胞正常发育受阻。大量研究表明,髓质(m)TECs可表达自身组织特异性抗原(TSAs),传递给胸腺内树突状细胞或直接提呈给发育中的T细胞,诱导阴性选择,可引起抗原特异性T细胞清除,刺激抗原特异性Tregs增加,起到阻止自身免疫性疾病发生的作用,但TECs有限的数量来源极大限制了其临床应用。已有研究证实,小鼠胚胎干细胞(m ESCs)来源的胸腺上皮祖细胞(TEPs)移植到体内,可分化为TECs,重建胸腺结构,促进T细胞发育,这为TECs的临床应用提供了充足的种子细胞来源。因此,将自身致病性抗原过表达在m ESCs内,并诱导分化为TEPs进行胸腺内移植的方法,可能诱导自身耐受,为MS的防治提供了新的途径,也为其它已知自身致病性抗原的自身免疫病的预防和治疗提供科学依据。目的:本课题通过建立小鼠MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),将引起MS的关键致病性抗原髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)过表达在m ESCs来源的TEPs(m ESC-TEPs)内,胸腺内移植,研究其是否能分化为TECs,改善胸腺微环境,促进T细胞发育,同时MOG在胸腺内持续表达,诱导针对MOG抗原的特异性耐受,达到防治MS的目的;并探讨防治作用的相关机制,是否与中枢耐受(自身抗原特异性T细胞删除或抑制)或/和外周耐受(抗原特异性Tregs增加)机制有关。方法:1.利用基因克隆和转染技术,构建带有绿色荧光蛋白GFP的重组质粒MOG-p EF1a-IRES-Ac GFP,转染TC-1 m ESCs,筛选获得MOG稳定表达的细胞株MOG/m ESCs。利用细胞因子表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子7/角质细胞生长因子(FGF7/KGF)、FGF10和骨形成蛋白4(BMP4)联合体外培养,诱导MOG/m ESCs分化为胸腺上皮祖细胞(MOG/TEPs)。取4-6周129S6Sv Ev Tac小鼠12只,分4组,每组3只进行胸腺内注射:实验组为注射MOG/TEPs基因转染细胞组、对照组分别为注射p EF1a/TEPs空载体转染细胞组、MOG/聚乙烯亚胺(PEI)质粒组和p EF1a/PEI空载体组。分别于注射后第2天、第30天和第90天取胸腺组织,Western blot、和流式细胞术(FACS)分析比较各组胸腺移植后,m ESC-TEPs数量、分布以及绿色荧光蛋白(GFP)和MOG蛋白持续表达情况。2.建立小鼠MS实验动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),研究MOG/TEPs细胞胸腺内移植对MS的预防作用。取4-6周TC-1 m ESCs同基因系129S6Sv Ev Tac小鼠35只,利用anti-Ep CAM抗体,运用免疫磁珠分选方法对培养的m ESC-TEPs细胞进行分选,获得MOG/TEPs(Ep CAM+)和MOG/Ep CAM-细胞,分5组作小鼠胸腺内注射:实验组为注射MOG/TEPs(Ep CAM+)细胞组、对照组分别为注射MOG/Ep CAM-细胞组、p EF1a/TEPs空载体转染细胞组、MOG/PEI质粒组和PBS组;作为平行实验,非同基因系的C57BL/6小鼠35只,致死量照射后,T细胞清除的骨髓(TCD-BM)移植,同时按上述5组分组进行胸腺内注射。8周后,MOG35-55小鼠背部皮下四点注射诱导EAE,逐日观察模型建立和发病进展情况,临床评分,42天后处死小鼠。① 取脊髓组织石蜡包埋切片,苏木精-伊红(HE)染色、卢卡斯快蓝(LFB)染色和Bielschowski镀银(BSI)染色,观察各组小鼠组织病理学改变并对组织切片进行半定量评分。② 取胸腺组织,分离胸腺细胞和TECs,FACS检测各组总胸腺细胞数、CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+或CD8+细胞数量变化;分析各组总TECs(CD45-Ep CAM1+)、c TECs(CD45-Ep CAM1+Ly51+)和m TECs(CD45-Ep CAM1+Ly51-)细胞数量变化。③ 取脾脏组织,分离脾细胞,不同剂量MOG35-55以及anti-CD3和anti-CD28抗体刺激培养,Brd U掺入检测脾细胞增殖情况。④ 收集各组MOG35-55刺激培养脾细胞上清,CBA试剂盒标记,FACS检测Th1/Th2/Th17细胞因子产物分泌情况。⑤ 收集各组小鼠血清,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测各组小鼠血清中抗MOG抗体产生情况。3.建立小鼠EAE模型,研究MOG/TEPs细胞胸腺内移植对MS的治疗作用。4-6周C57BL/6小鼠15只,MOG35-55注射诱导EAE,逐日观察发病及疾病进展情况;临床评分达1-2分后,小鼠致死量照射并TCD-BM移植,同时分三组进行胸腺内注射:实验组为注射MOG/TEPs细胞组、对照组为注射MOG/Ep CAM-细胞组和PBS组;注射后观察至第44天,MOG35-55再次免疫诱导EAE,继续进行临床评分,观察至第75天,处死小鼠,取脊髓观察各组小鼠脊髓组织病理学改变并对组织切片进行半定量评分。结果:1.成功克隆获得了重组质粒MOG-p EF1a-IRES-Ac GFP;建立了MOG/m ESCs细胞模型,该细胞可稳定表达MOG蛋白,AP染色呈阳性,可检测到OCT4和SSEA1干细胞相关基因表达,NOD-SCID小鼠皮下注射后,可形成畸胎瘤;体外可成功诱导分化MOG/m ESCs为MOG/TEPs,该细胞阳性表达Ep CAM1、K5和K8分子,Pax1、Pax9、Plet1、Fox N1和Hox A3基因m RNA表达量明显增加;MOG/TEPs胸腺内移植后,体内可分化为TECs细胞,胸腺内不同发育阶段T细胞数量较对照组增加,同时移植后90天仍可在胸腺内检测到MOG和GFP蛋白表达。2.MOG/TEPs移植对MS/EAE的动物疾病模型具有预防发病的作用:MOG/TEPs移植后129S6Sv Ev小鼠和C57BL/6小鼠发病率、平均临床分数和积累评分较各对照组低,组织切片观察,病理受损情况减轻。3.MOG/TEPs胸腺内注射对MS/EAE模型具有治疗作用:MOG/TEPs处理联合骨髓移植后,MOG35-55再次免疫,小鼠EAE临床评分降低,组织病理改变减轻。4.MOG35-55刺激培养后,MOG/TEPs处理组脾细胞增殖指数降低,IL-17、TNF和IFN-γ分泌减少,而抗CD3/CD28抗体刺激培养后增殖指数无明显变化。另外,MOG/TEPs处理后,小鼠胸腺和脾脏内CD4+CD25+Fox P3+细胞数量增加,血清MOG抗体浓度检测无明显变化。结论:本研究成功地将过表达MOG的m ESCs诱导分化为TEPs,并将该细胞移植到MS/EAE模型小鼠胸腺内,实现了有效预防MS/EAE模型小鼠疾病发生的目的,同时MOG/TEPs胸腺内注射联合骨髓造血干细胞移植对已建立的MS/EAE模型可达到长期缓解的治疗作用;该防治作用的发挥可能是通过中枢耐受(抗原特异性T细胞删除)和外周耐受(Tregs增加)机制的参与而实现的。