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第一部分肾间质纤维化大鼠中Prohibitin与氧化损伤的关系及其分子机制目的通过检测肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)大鼠肾脏组织PHB和氧化损伤指标氧自由基(](?)eactive oxygen species, ROS),丙二醛(malonaldehyde, MDA)等的变化,探讨prohibitin (PHB)与RIF大鼠肾脏组织氧化损伤关系及其分子机制。方法80只Wistar大鼠随机分为假手术组和模型组(n=40)。模型组大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后,行左侧输尿管结扎手术,假手术组大鼠麻醉后只探及肾包膜。分别于术后第2周末和第4周末每组大鼠各处死20只,Masson染色作病理学检查并计算肾间质RIF指数,应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应法(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)、免疫组织化学和Westem-blot方法检测肾脏组织PHB1、 PHB2、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的mRNA及其蛋白表达；用免疫组织化学和Western-blot方法检测肾间质及肾脏组织Ⅳ型胶原(collagen-Ⅳ, Col-Ⅳ)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN)的蛋白表达。应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferse-mediated nick end labeling, TUNEL)检测肾间质细胞凋亡情况；通过试剂盒测定氧自由基(reactive oxygenspecies, ROS),丙二醛(malonaldehyde, MDA),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)的含量。结果1.①与假手术组比较,模型组大鼠肾脏组织PHB1和PHB2的mRNA和蛋白表达均显著下降(P均<0.01)；与2周末模型组比较,4周末模型组肾脏组织PHB1和PHB2的mRNA及其蛋白表达均明显降低(P均<0.01)；②与假手术组比较,模型组大鼠肾脏组织TGF-β1的mRNA及其蛋白表达、Col-Ⅳ和FN蛋白表达、RIF指数均显著增高(P均<0.01)；与2周末模型组比较,4周末模型组大鼠肾脏组织TGF-β1的mRNA和蛋白表达、Col-IV]FN蛋白表达、RIF指数均明显增高(P均<0.01)；③与假手术组比较,模型组大鼠肾脏组织ROS和MDA含量均显著增高(P均<0.01),SOD和GSH含量均显著降低(P均<0.01),细胞凋亡指数明显增加(P<0.01)；与2周末模型组比较,4周末模型组肾脏组织ROS和MDA含量、细胞凋亡指数均明显增高(P均<0.01),肾脏组织SOD和GSH含量均明显降低(P均<0.01)。2.相关性分析：大鼠肾脏组织PHB1或PHB2蛋白表达与RIF指数和细胞凋亡指数、TGF-β1、Col-Ⅳ、FN的蛋白表达、ROS和MDA含量均呈显著负相关(P均<0.05),而PHB1或PHB2蛋白表达与SOD和GSH含量均呈显著正相关(P均<0.05)。PHB1蛋白表达与PHB2蛋白表达呈显著正相关(P<0.05)。肾脏组织ROS与TGF-β1、Col-Ⅳ、FN、RIF指数和细胞凋亡指数均呈明显正相关(P均<0.05)。结论在RIF大鼠中,肾脏组织PHB1和PHB2与氧化损伤关系密切。其分子机制可能是通过调节ROS、TGF-β1、Col-Ⅳ和FN表达,参与RIF的发生和发展。第二部分缺氧性RTEC中Prohibitin与氧化损伤的关系及分子机制目的探讨prohibitin(PHB)基因与体外培养的缺氧性肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)氧化损伤的关系及分子机制。方法构建pLPl-PHB1+、pLPl一PHB2+.pLP1-PHB1-、pLP1-PHB2-、阴性对照pLP1-eGFP病毒载体。因基因干扰实验需要而设立7个实验组：正常组、缺氧处理组(模型组)、PHB1+组、PHB2+组、PHB1-组、PHB2-组、阴性对照组。PHB1+组、PHB2+组、PHB1-组、PHB2-组、阴性对照组RTEC于添加基因干扰试剂48h与后行缺氧处理。缺氧处理的方法如下：将RTEC细胞置于真空干燥罐中,采用负压吸引器抽吸真空罐中残余气体,继而充以体积分数为95%N2和5%CO2的缺氧混合气体,密封的方法诱导缺氧性损伤；缺氧处理48小时收获各组细胞行相关检测。模型组RTEC只做缺氧处理48小时；而正常组RTEC不做任何处理。应用RT-PCR方法检测各组RTEC中PHB1、PHB2和TGF-＜β1的mRNA表达；应用Western-blot方法检测RTEC细胞PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-Ⅳ和FN的蛋白表达；流式细胞仪检测RTEC凋亡情况和线粒体膜电位△Ψm的变化；通过试剂盒测定ROS、MDA、SOD和GSH的含量；扫描电镜和透射电镜分别检测细胞形态变化和线粒体形态变化。结果1.与正常组RTEC比较,缺氧组RTEC中PHB1和PHB2的mRNA及其蛋白表达均显著下降(P均<0.01)；与缺氧组RTEC比较,PHB1-组或PHB2-组RTEC中PHB1和PHB2的mRNA及其蛋白表达均显著下降(P均<0.01)；与缺氧组RTEC比较,PHB1+组或PHB2+组RTEC中PHB1和PHB2的mRNA及其蛋白表达均显著增高(P均<0.01)。2.与正常组RTEC比较,缺氧组RTEC中TGF-β1的mRNA及其蛋白表达、Col-IV和FN的蛋白表达均显著增高(P均<0.01)；与缺氧组RTEC比较,PHB1-组或PHB2-组中细胞TGF-βi的mRNA及其蛋白表达、Col-Ⅳ和FN的蛋白表达均显著增高(P均<0.01);与缺氧组RTEC比较,PHB1+组或PHB2+组RTEC中TGF-β1的mRNA及其蛋白表达、Col-Ⅳ和FN的蛋白表达均显著降低(P均<0.01)。3.与正常组RTEC比较,缺氧组RTEC中ROS和MDA含量均显著增加(P均<0.01),SOD和GSH的含量均显著降低(P均<0.01)；与缺氧组细胞比较,PHB1-组或PHB2-组中RTEC细胞ROS和MDA含量均显著增加(P均<0.01),SOD和GSH的含量均显著降低(P均<0.01)；与缺氧组细胞比较,PHB1+组或PHB2+组RTEC中ROS和MDA含量均显著下降(P均<0.01),SOD和GSH的含量均显著增加(P均<0.01)。4.与正常组RTEC比较,缺氧组RTEC线粒体膜电位△Ψm明显降低(P<0.01),细胞凋亡明显增多(P<0.01),细胞形态出现萎缩,线粒体出现空泡状变化；与缺氧组细胞比较,PHB1-组或PHB2-组中细胞线粒体膜电位△Ψm明显降低(P<0.01),细胞凋亡明显增多(P<0.01),细胞形态萎缩加重,线粒体出现空泡状变化加重；与缺氧组细胞比较,PHB1+组或PHB2+组RTEC线粒体膜电位△Ψm明显增高(P<0.01),细胞凋亡明显减少(P<0.01),细胞形态出现萎缩减轻,线粒体出现空泡状变化减轻。5.相关性分析：PHB1蛋白表达与TGF-β1、Col-Ⅳ、FN、ROS、MDA和细胞凋亡均呈显著负相关(P均<0.05),PHB1蛋白表达与SOD、GSH和线粒体膜电位均呈显著正相关(P均<0.05)；PHB2蛋白表达与TGF-β1、 Col-IV、FN、ROS、MDA和细胞凋亡均呈显著负相关(P均<0.05),PHB2蛋白表达与SOD、GSH和线粒体膜电位均呈显著正相关(P均<0.05)。PHB1蛋白表达与PHB2蛋白表达呈显著正相关(P<0.05)。ROS含量与TGF-β1、Col-Ⅳ、FN和细胞凋亡均呈明显正相关(P均<0.05)。结论在体外培养的缺氧性RTEC损伤中,PHB1和PHB2表达显著降低参与了氧化损伤过程。上调PHB1和PHB2的表达具有抗氧化损伤的作用,其分子机制可能与PHB1和PHB2减少ROS、MDA等的产生,下调TGF-β1和ECM表达有关。