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[背景与目的]人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一种嗜上皮性病毒,有高度的特异性,有些型别HPV与恶性肿瘤发生的密切相关,称为高危型HPV。1995年世界卫生组织(WHO)、国际癌症研究学会(IARC)就将HPV16和18型归为致癌性的一类型中,同时宣布HPV感染是引起宫颈癌最主要的病因。近20年来的研究表明,高危型HPV感染除了与宫颈癌关系密切外,还可能与肺癌的发生、发展密切相关。肺癌是世界上发病率和死亡率最高的肿瘤之一,吸烟、大气污染等是肺癌发生的重要危险因素已得到大家的普遍认可,但其确切病因仍尚不十分明确。近20年来HPV感染与肺癌的病因学关系已逐渐引起研究者们的注意。云南省尤其是宣威、个旧地区肺癌的发生率和死亡率高居全国首位,近30年来,相关部门针对相关的防护措施采取了积极行动,但肺癌的发病率和死亡率仍居高不下,成为严重威胁我省人民生命健康的主要因素之一。HPV感染在云南地区肺癌的感染情况如何?二者是否具有相关性?阐明二者的关系将对云南地区肺癌的防治具有十分重大的意义。本课题我们拟对收集的云南地区的94例肺癌,48例肺良性病变的新鲜冰冻组织标本进行HPV DNA检测并分型,了解云南地区肺癌HPV感染情况及常见HPV型别。E6和E7是HPV基因组早期区基因编码的主要的致癌蛋白。将HPV-16E6-E7基因整合入A549细胞中的关键在于载体的选择。慢病毒载体(Lentivirus vector)具有感染谱广泛,能有效感染各期细胞,转移基因片段容量大,长期稳定表达外源基因等显著优点,且不产生任何有效的细胞免疫应答,是将基因整合入细胞的良好运载工具。本研究设计通过将重组HPV-16E6-E7基因的慢病毒感染人肺腺癌A549细胞,分析观察HPV-16E6-E7基因转染对肺腺癌A549细胞生物学行为所发生的变化。miRNA (microRNA)在生物体生长发育、细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等细胞生物学过程中起着非常关键的作用。许多肿瘤中有的miRNAs表达上调,有的miRNAs表达下调,可能发挥着癌基因或抑癌基因的作用。目前对HPV相关非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC) 的 miRNAs表达改变的研究较少。本研究采用miRNA表达谱芯片技术结合实时荧光定量PCR检测检测人肺腺癌A549细胞转染HPV-16 E6-E7前后miRNAs表达水平的变化,以期探索HPV-16感染对肺癌niRNAs表达的影响,为高危HPV致癌机制提供实验依据。[方法]1、收集94例非小细胞肺癌(NSCLC)和48例肺良性病变组织,应用基因组DNA小量试剂盒提取组织标本基因组DNA；通过基因测序法对HPV-DNA阳性标本的型别进行检测。2、结合病人的临床资料,对HPV感染与肺癌的相关性进行分析。3、采用基因重组技术获得HPV-16 E6-E7基因的慢病毒,通过基因测序等方法鉴定其准确性。4、重组HPV-16 E6-E7’漫病毒进行包装后感染人腺癌A549细胞,通过RT-PCR和Western-blot验证转染得到A549细胞能表达目的基因E6-E7及E6、E7蛋白。5、用CCK-8试剂盒、流式细胞仪、酶联免疫吸附法、Transwell、室等检测重组HPV-16 E6-E7慢病毒感染A549细胞的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、体外侵袭能力等方面的变化。6、应用基因芯片和qPT-PCR的方法对人肺腺癌A549细胞转染HPV-16 E6-E7前后miRNAs表达谱进行分析。[结果]1、94例非小细胞肺癌标本HPV阳性者28例,总阳性率为29.8%(28/94)；48例肺良性病变组织HPV阳性者5例,阳性率7.8%(5/48)。经测序分型均为单纯HPV-16型感染。2、HPV阳性与HPV阴性肺癌组进行比较分析,二者在年龄、性别、吸烟史、病理类型、分化程度及TNM分期之间的差异无统计学意义(P>0.05)。3、重组获得的HPV-16 E6-E7基因的慢病毒载体经基因测序表明连接正确。4、经重组IPV-16E6-E7慢病毒感染、RT-PCR和Western-blot验证,获得了稳定表达E6-E7基因的A549细胞。5、HPV-16 E6-E7基因转染人肺腺癌A549细胞后,G0/G1期细胞比例减少,S期和G2/M期细胞比例增加,凋亡减少,细胞增殖活跃,侵袭力增强。6、基因芯片检测结果显示：在转染HPV-16 E6-E7基因的肺腺癌A549细胞中,9个miRNA是下调的,12个miRNA是上调的,其中hsa-miR-7d-5p的上调最显著。[结论J1、HPV感染与云南地区NSCLC的发生相关,云南地区肺癌感染的HPV型别主要是HPV-16型。2、HPV-16感染与非小细胞肺癌患者的年龄、性别、吸烟、病理类型、分化程度及TNM分期均无关。3、HPV-16 E6-E7基因转染人肺腺癌A549细胞后,凋亡减少,细胞增殖力和侵袭力增强。4、HPV-16 E6-E7基因转染肺腺癌A549细胞后,hsa-miR-7d-5p的上调最显著。hsa-let-7d-5p可能是与HPV致癌过程关系最为密切的miRNA;