嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是一种中度嗜热嗜酸化能自养革兰氏阴性硫氧化细菌,能够氧化还原型无机硫化合物以获得生长所需的能量。嗜酸性喜温硫杆菌在生物浸矿过程中发挥着重要作用,但是由于其生长速率慢,有机质敏感,嗜酸性环境,硫代谢系统复杂等不利因素的影响,使得对嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢的研究进展缓慢。硫氰酸酶是一种硫代硫酸盐硫转移酶,广泛存在于各种生物体的各种代谢过程中。虽然已经发现了七十余年,由于其生物学底物不是很清楚,所以其功能仍然备受争议。在嗜酸性喜温硫杆菌A. caldus MTH-04基因组中发现四个硫氰酸酶基因,其中rhd2475所在的基因簇在其他嗜酸性喜温硫杆菌菌株以及氧化亚铁嗜酸硫杆菌中通过组学方法被证明可能参与硫代谢过程。为更好地阐述硫氰酸酶在嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢过程中的作用,本论文通过异源表达并纯化得到硫氰酸酶,鉴定其酶学性质。同时通过基因敲除的方法对硫氰酸酶的作用进行研究。首先通过启动子分析以及反转录PCR实验讨论了硫氰酸酶基因敲除的可行性,而后构建置换敲除自杀质粒pRE-rhd,利用接合转移的方法在卡那霉素抗性平板上筛选敲除菌株,结果发现得到的57株菌株全部为单交换菌株,可能由于硫氰酸酶为必需基因,敲除造成致死突变。因而构建了I-Sce Ⅰ的表达及硫氰酸酶回补质粒pIS-rhd,并且在置换敲除自杀质粒pRE-rhd的基础上,加入归位内切酶I-Sce Ⅰ识别位点,构建了无痕敲除自杀质粒pML-rhd。通过接合转移的方法利用抗生素筛选得到单交换菌株,将质粒pIS-rhd导入单交换菌株中,胞内表达产生的l-Sce Ⅰ识别整合到染色体上的特异性位点,并切割后诱发细胞内的重组修复机制,从而增加同源重组的概率并得到无痕敲除菌株。在挑取的150个菌落中筛选得到了3个突变菌和7株野生菌,对嗜酸性喜温硫杆菌中必需基因的无痕敲除进行了探索。