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C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP),作为急性期蛋白的原型,近来被证实对动脉粥样硬化进展造成的心血管突发事件具有良好的预示价值,而且越来越多的证据表明CRP直接参与了动脉粥样硬化的形成。外周血单核细胞募集,巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP),泡沫细胞摄取氧化的低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,OX-LDL)是动脉粥样硬化形成和发展的重要步骤,本实验预对CRP对以上三个过程的影响进行探讨,而且有证据表明动脉粥样硬化局部的细胞成份可表达CRP,这种类似于自分泌和旁分泌的作用是CRP参与动脉粥样硬化的又一例证,本实验还将对巨噬细胞表达CRP进行研究。 方法: 本文采用单核细胞系THP-1细胞和人外周血单核细胞作为材料,利用流式细胞仪、半定量RT-PCR、明胶酶谱及ELLSA检测单核细胞表面CC细胞因子2(CC Chemokine Receptor 2,CCR2)、CD11b和CD36的表达,细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9、MMP-1的活性,巨噬细胞内胆固醇含量以及细胞培养上清液中CRP含量,从这些方面揭示CRP在动脉粥样硬化发生和发展中的作用。 结果: (1)流式细胞仪和RT-PCR结果都显示CRP以剂量依赖性方式抑制人外周血单核细胞和THP-1细胞表达CCR2和CD11b(p<0.05),脂蛋白对THP-1细胞表达CCR2和CD11b的作用不同:OX-LDL诱导CCR2和CD11b的表达(p<0.01,n=4),而高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)抑制此二者的表达(p<0.01,n=4),低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)则对其无显著影响(p<0.01,n=4)。CRP抑制OX-LDL所诱导的CCR2(115.75±6.4比99.12±3.65,p<0.01,n=4)和CD11b(121.25±4.79±98.5±4.93,p<0.01,n=4)的表达增加,并与LDL显著地协同作用于CCR2(101.80+2.59摘要比161.77士10.82,P<0.01,n=4)CDllb(102.14士2.73比147.14士12.14,p<0.01,n二4),但CRP对CCRZ和CDllb的诱导作用可被HDL所削弱。RT一PCR结果也符合以上规律。 (2)在所有实验组中Ce咫(二0.613,p<0.01)和CDllb份0.615,p<0.01)分别与培养上清液中NO含量相关,且ccRZ与CDllb也相关(二0.883,p<0.01)。 (3)P做刺激的由THP一l细胞分化的巨噬细胞在基础状态下分泌MMP一2、枷P一9、枷P一1,CRP抑制其分泌,以MMP一2为例,CRP抑制枷P一2的酶原(0.82士0.05,与空白对照组比较p<0.01)和其活性形式 (0.61土0.03,与空白对照组比较P<0.01)。ox一LDL诱导MMp的分泌,但这种作用被同时存在的CRP所抑制(0.56士0.10,与ox-LOL组比较P<0 .01)。 (4) Ox-LOL显著增加巨噬细胞内胆固醇的积累(0.323士0.023比0.150士0.013 nmol/pg蛋白,P<0.01),而CRP明显降低巨噬细胞内胆固醇的含量,lpg/ml的C即就有此作用(0.212士0.028比0.150士0.013nmol/“g蛋白,p<0.01),10 p g/ml的CRP对胆固醇累积的抑制作用最大(0.195士0.011 nmol/pg蛋白)。同时Rl’- pCR也显示C”在转录水平上降低 CD36的表达(p<0.01)。 (5)外周血单核细胞(pe五pheral blood mononuclear eells,pBMC)来源的巨噬细胞和THP一1分化的巨噬细胞均可表达C即,在基础状态下PBMC本身可表达cRP,浓度相对较低,为0.448士o.368nglm!,Ox一LDL以浓度依赖性方式显著增加PBMe生成C即,100 p g/ml0X一LDL使pBMC分泌的CRP增至8.1巧士o.433ng/ml,与基础状态比较增加约50倍(与空白组比较,p<0.01),但后来加入的LPS可降低相应浓度的Ox一LDL所诱导的e即的表达(oxso+LPsl组与oxso组比较,p<0.01)。以pMA诱导分化的巨噬细胞为材料时也得到了类似的结果,并得到Rl’- PCR的进一步证实。 结论:摘要 (1)CRP诱导单核细胞表达CCRZ和CDllb,并调节脂蛋白对CCRZ和 CDllb的影响; (2)CRP抑制活化的巨噬细胞分泌MMP一2、MMP一9、枷P一1,并抑制OX一LDL 对MMP的诱导作用; (3)CRP抑制巨噬细胞起源的泡沫细胞中胆固醇的积累,此作用至少 部分是通过抑制CD36的转录来实现的; (4)巨噬细胞本身可合成C即,并受OX一LDL的上升调节。