第一章PHⅡ-7作用模式和机理研究多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物出现耐药的同时,对其他结构不同、作用靶位不同的化疗药物亦产生抗药性,是肿瘤化疗失败和复发的根源。多药耐药的产生是多机制作用多基因参与的复杂过程,ATP结合盒(ATP Binding Cassette,ABC)家族基因过表达已被证明是MDR产生的重要原因,MDR1是ABC家族中最早被发现,影响最广泛,最为重要的MDR相关基因,围绕MDR1的MDR机理研究及逆转MDR研究的重要性日益凸显。多药耐药作为肿瘤化疗中的常见现象,当今仍然是化疗失败和肿瘤病人死亡的最主要原因之一。针对肿瘤MDR的产生过程,应用多药耐药逆转剂是解决肿瘤MDR的主要手段。经过二十多年的开发研究,已发现大量具有MDR逆转活性的化合物,主要包括:钙通道阻滞剂(维拉帕米及其衍生物)、钙调蛋白抑制剂(噻吩嗪类化合物)、免疫抑制剂(环孢菌素A及其衍生物)、类固醇和激素类似物(黄体酮、甲地孕酮)等。但这类逆转剂的毒副作用也使其临床应用受到限制。中药当归龙荟丸可有效治疗有效治疗慢性粒细胞性白血病,我室以其有效成分靛玉红为模板,经定量构效关系研究,从合成的几十种衍生物中筛选出PHⅡ-7。本实验是对其活性和作用机理进行研究。首先,在杀伤活性试验中,我们通过MTT实验发现PHⅡ-7对K562细胞及其耐药株K562/A02均有明显的杀伤作用,且IC50相近。而K562/A02对作为阳性对照的阿霉素的IC50值则比K562高出近百倍应用表达谱芯片AFFYMETRIX Genome u133 plus2.0辅以SYBR GREEN REALTIME PCR验证,研究PHⅡ-7作用前后的前述两细胞系发现,经典多药耐药基因MDR1表达量下调,与其磷酸化和功能密切相关的基因PKCA显著下调。与S期细胞周期阻滞、凋亡、细胞衰老密切相关的P21,CHK1等基因显著上调。激光共聚焦成像发现PHⅡ-7作用后K562/A02细胞内ADM蓄积明显增加,流式细胞术发现这种降低呈时间依赖性。凋亡和周期实验证明PHⅡ-7作用后细胞周期发生阻滞,细胞凋亡增加。PHⅡ-7可以抑制经典耐药基因MDR1的表达,并可显著抑制PKCA的表达,通过使用SiRNA沉默PKCA的表达发现,K562/A02细胞中PKCA的下调可导致c-FOS,c-JUN和MDR1基因的显著下调,提示PHⅡ-7通过PKCA-AP1-MDR1信号通路下调MDR1基因的表达,从而逆转耐药肿瘤细胞的耐药状态。并通过作用于有关基因导致细胞周期阻滞,并诱导凋亡。PHⅡ-7同时具备了内在肿瘤细胞杀伤活性和通过PKCA通路影响MDRL基因的表达从而具备逆转耐药表型的活性,有可能成为克服肿瘤化疗中多药耐药现象的一种新的解决方案。第二章SiRNA沉默SORCIN基因表达对K562/A02基因表达谱的影响的研究目的:以人多药耐药白血病细胞系K562/A02为模型,研究其中高表达的耐药相关基因sorcin的功能及其介导多药耐药的可能机制和涉及的调控通路,为后续研究提供线索,为逆转肿瘤多药耐药提供新的靶点。方法:设计并用体外转录法合成针对人sorcin基因的小干扰RNA,脂质体法转入K562/A02细胞,提取总RNA并行反转录,应用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)法检测sorcin基因表达的抑制效果。通过Affymetrix U133 plus2.0基因表达谱芯片检测干扰组与对照组K562A02细胞转录水平基因表达的差异。结果:成功设计并合成了针对人sorcin基因的siRNA,转染后检测得知sorcin基因的转录抑制率为80%以上,用基因表达谱芯片检测,发现与对照组比较,干扰sorcin导致42个基因显著下调,37个基因显著上调。下调的基因主要包括:FOS,PDGFC,MYO3B;上调的基因主要包括IL8,FGF18,CCNG2。结论:通过特异下调sorcin的表达,筛选干扰组和对照组转录水平差异明显的基因,发现sorcin可能通过调控MDR1表达等主要途径介导K562/A02细胞的多药耐药。其中IL-8、PDGF等表达发生明显变化,提示sorcin介导K562/A02细胞耐药可能与c-FOS,IL-8和PDGF等有关。