研究背景卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤。当今辅助化疗是晚期卵巢癌的重要治疗手段，而紫杉醇联合铂类已成为卵巢癌标准的一线化疗方案。虽然该化疗方案可使晚期卵巢癌的近期缓解率达到80％以上，但大多数患者在2～3年内复发，几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药，对紫杉醇化疗的获得性耐受已成为卵巢癌患者治疗失败和死亡的重要原因，阐明其耐药机理，对逆转耐药以保证化疗持续有效和患者长期生存，具有重要意义。紫杉醇（paclitaxel）是1971年从美国西部短叶红豆杉中分离提取出来的一种天然抗肿瘤药物，具有独特的抗癌机制，紫杉醇的主要靶点是微管蛋白及微管系统，它通过促进微管聚合，使细胞增殖阻滞于G₂／M期，最终导致细胞死亡。目前紫杉醇已成为包括卵巢癌在内多种实体瘤的首选细胞毒药物，但是获得性耐药仍是制约其临床疗效的主要问题。卵巢癌细胞对紫杉醇耐药的可能机制主要包括：P-gP等膜转运分子表达上调导致细胞内药物浓度降低；β微管蛋白表达改变；抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调等凋亡信号途径调控异常以及紫杉醇耐药相关基因TRAG-3和睾丸癌抗原基因（TRAG-3／CSAG2）过表达等。但目前已揭示的机制难以解释临床复杂的药物耐受现象，一系列针对这些可能机制而设计的临床试验的效果也非常有限，故有必要探索新的耐药相关分子，为进一步研究紫杉醇耐药机制奠定基础。近年来多项研究发现，在化疗耐受的多种实体瘤组织和细胞中存在热休克蛋白27（HSP27，也称HSP25）表达上调，HSP27与化疗耐受相关，我们先前的研究也发现，在中等剂量间歇作用结合低剂量紫杉醇持续诱导法建立的耐紫杉醇的细胞株SKOV3-TR30中，存在HSP27表达上调。结合已有研究表明HSP27可通过抑制凋亡、稳定细胞骨架等多个机制导致药物耐受，HSP27很有可能是紫杉醇这一微管靶向药物的新的耐药相关分子。HSP27是高度保守的小分子热休克蛋白超家族成员之一，作为分子伴侣蛋白，它可协助细胞内多种蛋白进行正确的折叠组装、准确的细胞内定位和及时的降解。HSP27的生物学功能极为广泛，它参与调节细胞的增殖、分化以及神经系统的发育等生理活动；在机体受到高温、紫外线、药物等刺激时，HSP27通过抑制凋亡、稳定细胞骨架系统等途径发挥细胞保护作用。HSP27各种功能的发挥主要依赖于其表达水平和细胞内分布状态。HSP27的表达主要由其转录水平决定，人支架黏附因子B（Homo sapiens scaffold attachment factorB，SAFB）负责编码一种核基质蛋白（NMP），可通过与HSP27启动子上游的TATA盒结合抑制HSP27的转录，进而降低HSP27表达。生理情况下HSP27以约700kDa的寡聚体形式存在并主要分布于细胞浆内，热休克或其它应激下可向核内转移，目前HSP27入核后的作用仍不清楚。HSP27和卵巢癌的化疗耐药现象也有密切联系。研究发现HSP27表达上调是卵巢癌独立的预示预后因素，对在位卵巢癌组织和细胞株的研究也提示HSP27表达上调与临床化疗反应和体外的药物耐受有关。但目前关于HSP27在卵巢癌化疗耐药中的作用尚存在着诸多争议，如Piura等报道HSP27过表达可降低卵巢癌化疗敏感性，Germain等的研究表明两者无相关性，Aarts等则发现低表达或不表达HSP27的卵巢癌对化疗反应性较好，中位生存期延长。故HSP27在卵巢癌耐药中的作用及其机制仍需进一步探索。综上所述，为明确HSP27与紫杉醇耐受的关系并进一步探索HSP27在卵巢癌细胞对紫杉醇的获得性耐药过程中的作用，我们利用已建立的稳定耐受紫杉醇的卵巢癌细胞株SKOV3-TR30（存在HSP27蛋白表达上调），应用免疫印迹和免疫荧光方法观察紫杉醇作用后的耐药卵巢癌细胞与其亲本细胞内HSP27蛋白的表达改变，并通过siRNA干扰技术下调SAFB编码蛋白和HSP27以改变HSP27表达水平，然后观察HSP27表达水平改变后原细胞对紫杉醇敏感性和细胞凋亡水平的改变，旨在为临床预示卵巢癌的治疗反应和治疗卵巢癌提供新靶。研究目的明确HSP27与紫杉醇耐药相关性，探讨HSP27在卵巢癌SKOV3细胞株对紫杉醇获得性耐药中的作用。材料与方法选择卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3-TR30为研究对象，以敏感细胞株SKOV3为对照，在细胞培养基础上：1．运用免疫印迹、免疫细胞荧光等方法，观察不同作用浓度（50、150、300、500、1000nM）和时间（24、48、72小时）紫杉醇对SKOV3-TR30和SKOV3细胞中HSP27蛋白表达水平和细胞内定位的影响。2．构建针对SAFB和HSP27的siRNA慢病毒载体（由上海吉凯生物有限公司完成），分别干扰SKOV3中的SAFB基因和SKOV3-TR30的HSP27的表达，并利用MTT法检测HSP27表达水平改变后细胞对紫杉醇的敏感性。3．利用Annexin V／PI双标、流式细胞仪检测500nM紫杉醇作用24小时后的SKOV3，SKOV3-TR30和SKOV3-TR30／HSP27-siRNA细胞的早期凋亡水平。结果1．免疫印迹结果显示随着紫杉醇作用浓度的增大，SKOV3-TR30细胞中HSP27表达稳定，各浓度组间无显著差异（P＞0.05）。而SKOV3各组和未加药组（0nM）间的HSP27表达差异均有统计学意义（P＜0.01），除50nM组和150nM组间外，其余各组间的HSP27表达也有显著性差异（P＜0.05），提示随着紫杉醇作用浓度的增加，SKOV3细胞中HSP27蛋白的表达随之下降。300nM紫杉醇分别作用24、48、72小时后，SKOV3-TR30细胞中HSP27表达稳定，各时间组间无显著变化（P＞0.05）。而随紫杉醇作用时间的延长，SKOV3细胞中HSP27蛋白整体呈显著下降趋势，24小时组、48小时组、72小时组间与药物作用前（0nM）相比均有显著差异（P＜0.01），24小时组与48小时组间无显著差异（P＞0.05），48小时组和72小时组有显著差异（P＜0.01）2．紫杉醇可诱导SKOV3中的HSP27向核内转移。紫杉醇对SKOV3-TR30细胞中HSP27的表达水平和细胞内定位均无显著作用。3．通过SAFB-siRNA上调SKOV3细胞中HSP27的表达水平，结果显示：SAFB-siRNA干扰组和阴性对照组在10nM和100nM紫杉醇作用后的生存率有显著差异（P＜0.05），前者对紫杉醇的敏感性明显降低。更大浓度紫杉醇对SAFB-siRNA干扰前后的SKOV3细胞的敏感性无差别（P＞0.05）。通过HSP27-siRNA下调SKOV3-TR30细胞中HSP27的表达水平，结果显示：1nM紫杉醇作用后，HSP27-siRNA干扰组和阴性对照组的生存率无显著差异（P＞0.05），10nM及以上浓度紫杉醇作用后两者的生存率有显著差异（P＜0.05），HSP27-siRNA干扰组对紫杉醇的敏感性显著增加。4．500nM紫杉醇作用24小时后，HSP27 siRNA干扰后SKOV3-TR30细胞的早期凋亡水平显著高于干扰前的SKOV3-TR30细胞凋亡水平（P＜0.05）。结论一．HSP27的表达促进卵巢癌细胞对紫杉醇获得性耐药的发生和维持。二．HSP27可通过凋亡等途径调节卵巢癌对紫杉醇药物反应性。