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柱型苹果作为苹果生产中的丰产树型之一,是苹果高度密植栽培的理想品种。决定柱型苹果遗传特性的柱型基因Co与调控树型发育的重要内源激素——赤霉素(GA)之间的关系是苹果柱型突变分子机制研究的热点问题。
本试验以柱型苹果“威赛克”及非柱型苹果“旭”为试材,利用苹果DELLA相关基因的序列信息设计了特异引物,通过PCR扩增克隆目的基因。将目的基因插入至pCAMBIA1305.1植物表达载体中,农杆菌EHA105介导的叶盘法转化本生烟,并通过PCR、RT-PCR以及GUS染色法检测转基因植株;将目的基因插入至GFP瞬时表达载体pEZ-NL,中,通过基因枪法,转入洋葱表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察目的基因蛋白的亚细胞定位。试验结果如下:
1.从苹果“威赛克”和“旭”中克隆了2个与DELLA相关的基因——MdRGL1a、MdRGL2a,长度分别为1920bp、1743bp。经DNAMAN软件分析,威赛克、旭的MdRGL1a,威赛克、旭的MdRGL2a核苷酸序列同源性为100%;所推测的氨基酸序列均含有.DEllA蛋白家族所特有的结构区域。初步表明这两个基因在苹果不同品种间高度同源,与苹果威赛克的柱型突变无关。
2.构建了植物表达载体pRGL1a-GUS、pRGL2a-GUS,MdRGL1a、MdRGL2a转基因植株分别经潮霉素筛选,以及PCR、RT-PCR检测、GUS染色验证.MdRGL1a、MdRGL2a基因成功转入烟草植株中。
3.构建得到GFP瞬时表达载体pRGL1a-GFP、pRGL2a-GFP,荧光定位初步确定MdRGL1a和MdRGL2a蛋白主要定位在细胞核上。