CmNAC2和CmZincfinger1在菊花绿色性状形成与保持过程中的功能初探

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gongshurong20090907
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菊花作为中国十大传统名花之一,其不同品种间存在着花色素种类的差异和不同花色素的组合从而产生了菊花品种丰富的花色表型,因而广受人们的喜爱。至今已经明确了黄色系、粉色系、紫色系、墨色系、红色系和橙色系菊花的主要呈色物质,但对于绿色系菊花的研究相对较少。因此,对绿色菊花进行表型及色素分析,探究其呈色的分子机理具有重要的理论与现实意义。本研究通过对不同菊花材料进行色素种类和色素含量的分析,明确叶绿素是绿色系菊花的主要呈色色素。选取舌状花分别为白色、浅绿和深绿的3种菊花材料进行转录组分析,结合对切花绿菊‘绿扣’进行ABA和暗培养等外源处理后的基因表达检测,筛选了叶绿素合成相关的转录因子,并对其进行初步的功能验证。主要结果如下:1、叶绿素是绿色系菊花的主要呈色色素本研究对白色菊花野生种毛华菊和6个绿色菊花品种‘春晓’、‘绿牡丹’、‘绿宝石’、‘绿叮当’、‘Greenlizard’以及‘绿安娜’的舌状花进行色素种类和色素含量的分析,发现从毛华菊到‘绿安娜’a*值从-1.66逐渐降到-12.4,意味着绿色在增强,红色在减退,与之相对应地,总类胡萝卜素含量、总叶绿素含量均逐渐升高,以叶绿素含量变化最为显著。此外,所有品种在530nm处均无吸收峰,意味着其舌状花中均不含花青苷。而总黄酮的测定结果表明,7个品种菊花舌状花中的总黄酮并没有明显变化规律。综上,我们初步判断绿色系菊花的主要呈色色素是叶绿素。2、筛选得到2个可能在叶绿素合成调控中具有重要作用的转录因子片段,分别命名为CmNAC2和CmZincfinger1基因基于毛华菊(白色)、‘春晓’(浅绿)和‘绿安娜’(深绿)以同一花期(盛花期)的舌状花混合取样获得的转录组数据,筛选得到了叶绿素合成相关的18个unigene,叶绿素降解相关的8个unigene,以及转录组中差异表达的转录因子片段45个unigene,共71个unigene。为明确候选转录因子unigene和叶绿素合成降解相关基因之间的共表达关系,对切花菊‘绿扣’进行了暗处理、100μM GA处理、50μM STS和20μM ABA处理。通过荧光定量PCR检测了候选转录因子基因和叶绿素合成降解相关基因在毛华菊、‘春晓’和‘绿安娜’中的差异表达,结合其在经过不同处理的‘绿扣’中的差异表达,以及在‘春晓’不同开放时期最外轮舌状花中的表达情况,最终挖掘得到可能在叶绿素合成调控中发挥着重要作用的2个unigene,分别命名为CmNAC2和CmZincfinger1基因。3、CmNAC2和CmZincfinger1促进了叶绿素的合成,延缓了菊花叶片的黄化通过3’RACE、FPNI等克隆成功获得CmNAC2和CmZincfinger1基因的3’-UTR、5’-UTR以及完整的ORF序列,将CmNAC2和CmZincfinger1基因在切花绿菊‘绿扣’叶片中进行瞬时沉默和超表,沉默结果表明,CmNAC2和Cm Zinc finger1瞬时沉默均对叶色无明显改变,其具体情况有待进一步研究;超表结果表明,CmNAC2和CmZincfinger1瞬时超表一定程度上延缓了菊花叶片的黄化,与其叶绿素含量呈正相关,并且在CmNAC2和CmZincfinger1超表的‘绿扣’叶片中,部分叶绿素合成基因(HEMA1、CHLI1、CHLM1和CRD1)的表达均一定程度的上调。4、CmNAC2和CmZincfinger1对叶绿素合成相关基因HEMA1和CRD1启动子活性的调节使用FPNI的方法,克隆到1652bp的HEMA1基因启动子序列和1580bp的CRD1启动子序列,并通过限制性酶切,构建到PBI121载体。通过农杆菌的介导,侵染本氏烟草叶片。GUS酶活分析结果显示,和super1300空载相比,CmNAC2增强了HEMA1启动子的活性达2倍,而抑制了CRD1启动子的活性;CmZincfinger1增强了HEMA1启动子的活性达4倍,并且显著增强了CRD1启动子的活性达16倍。本研究筛选到转录因子基因CmNAC2和Cm Zinc finger1,并初步研究了其在菊花叶绿素合成过程中的功能,为深入探究菊花绿色形成的呈色分子机理提供了一定理论依据。
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