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亚急性瘤胃酸中毒(Subacute rumen acidosis,SARA)是现代反刍动物集约化养殖中常见的一类营养代谢病,在国际上备受学者关注。前期该领域的研究工作仅限于SARA对反刍动物瘤胃上皮的影响,然而对其肠道上皮屏障功能影响的报道较为罕见。为此,本论文将从组织、分子以及组学层面系统研究SARA对奶山羊肠道上皮屏障功能的损伤及其可能调控机制。1.SARA对奶山羊肠道上皮形态结构的影响本试验选用12只体况良好、体重相近(62.13±4.76kg)、安装有永久性瘤胃瘘管的泌乳奶山羊,随机分成两组,即对照组(n=6)和SARA组(n=6)。对照组饲喂NFC/NDF为1.15的基础日粮,SARA组依次饲喂NFC/NDF为1.15、1.49、2.12和2.66的4种试验日粮诱导奶山羊发生SARA,每种日粮持续饲喂15 d,为期60 d,在每种日粮饲喂结束前3 d采用pH酸度计对瘤胃pH值进行连续监测,以此作为判定SARA发生的依据,当一天内瘤胃pH值在5.2～5.5持续时间长达3 h以上即视为SARA模型建立成功。在此基础上,分别选取对照组及SARA组各3只奶山羊禁食12 h后进行屠宰,采集十二指肠、空肠、盲肠和结肠各段中间部位上皮组织,利用光学显微镜和透射电镜技术,对肠道上皮形态结构、细胞间超微结构进行观察。结果表明:(1)SARA显著提高了奶山羊十二指肠和空肠的绒毛高度、隐窝深度(P<0.05),黏膜厚度在空肠中显著升高(P<0.05),在十二指肠中升高但无显著性差异(P>0.05);SARA降低了十二指肠(P>0.05)和空肠(P<0.05)的绒毛高度/隐窝深度比值,同时使盲肠和结肠上皮表面出现严重的细胞凹陷及隐窝坏死。(2)SARA使奶山羊十二指肠、空肠和结肠上皮细胞间紧密连接的电子密度降低,细胞间隙增大,线粒体肿胀,部分线粒体脊断裂或消失。以上结果表明:SARA破坏了肠道上皮的形态结构,使其完整性受损。2.SARA对奶山羊肠道上皮通透性的影响试验设计、试验动物及日粮均与试验一相同。利用Ussing chamber系统测定肠道上皮组织电生理参数和异硫氰酸荧光素-葡聚糖4(FD4)流速,并对血浆LPS、D-乳酸含量及DAO活性进行检测,以此来反映SARA对奶山羊肠道上皮通透性的影响。结果表明:(1)SARA组奶山羊十二指肠、空肠和结肠上皮的Isc、Gt和FD4流速显著高于对照组(P<0.05),其PD显著低于对照组(P<0.05)。(2)与对照组相比,SARA组奶山羊血浆LPS、D-乳酸含量及DAO活性均显著升高(P<0.05)。以上结果表明:发生SARA的奶山羊,其肠道上皮通透性显著增加。3.SARA对奶山羊肠道上皮细胞间紧密连接蛋白表达的影响试验设计、试验动物及日粮均与试验一相同。本试验分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫组化SP法及免疫印迹技术(Western-Blot)检测肠道上皮Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7、Occludin 及 ZO-1 基因的 mRNA 表达水平和蛋白表达水平的变化,以期从分子水平揭示SARA对奶山羊肠道上皮屏障功能的损伤机制。结果显示:SARA显著上调了十二指肠上皮Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7及ZO-1的mRNA表达水平和蛋白表达水平(P<0.05),上调了 Occludin的mRNA表达水平(P<0.05)和蛋白表达水平(P>0.05);同时显著上调了空肠上皮Claudin-4、Claudin-7、Occludin及ZO-1的mRNA表达水平和蛋白表达水平(P<0.05),下调了 Claudin-1的mRNA表达水平和蛋白表达水平,但无显著性差异(P>0.05);也上调了结肠上皮 Claudin-1(P<0.05)、Claudin-4(P>0.05)及 Occludin(P<0.05)的mRNA表达水平和蛋白表达水平,下调了Claudin-7(P>0.05)和ZO-1(P>0.05)的mRNA表达水平和蛋白表达水平。以上结果表明:SARA改变了肠道上皮紧密连接基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平,且在不同肠段的表达水平有所不同。4.SARA对奶山羊十二指肠组织的转录组学分析本试验利用RNA-seq技术对奶山羊十二指肠组织进行转录组测序。结果表明:对照组和SARA组经过滤共获得30 GB的Clean reads。样本匹配到基因组的总基因数为26 724个,其中只在对照组表达的基因有273个,只在SARA组表达的基因有473个,在两个处理组中均表达的基因有12 989个。采用edgeR软件对基因表达量做差异表达分析,以显著水平P<0.05及|log2FC| ≥ 1为标准筛选差异表达基因(DEGs),结果共获得495个DEGs,其中有177个基因表达上调,318个基因表达下调。将筛选得到的DEGs进行GO功能注释和KEGG pathway富集分析,结果显示,这些上调基因主要与细胞凋亡、炎症反应、白细胞迁移等功能相关,而下调的基因主要与离子转运、脂肪酸代谢、脂质转运(代谢)、有机酸转运(代谢)等功能相关,并且这些DEGs主要富集到紧密连接信号通路、趋化因子信号通路和钙离子等信号通路上。上述结果表明:SARA破坏了肠道上皮的形态结构,导致肠道上皮屏障功能受损,通透性增加。