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人工合成有机卤化物1,2,3-三氯丙烷(TCP)是近年来公认的一个地下水污染物,主要作为溶剂、土壤熏蒸剂前体及合成其他化合物的前体大量使用,截止2013年,TCP在全世界的生产数量已达每年50000吨,庞大的生产量造成诸多工业废物排放到环境当中,威胁着人类健康。而传统的物理化学方法的治理效果往往达不到要求,且容易造成二次污染。因此,应用生物降解该类化合物已成为国内外研究的热点。微生物降解途径中含有卤代烷烃脱卤酶、卤醇脱卤酶及环氧化物水解酶三种关键酶,游离状态下的酶对环境变化十分敏感,易变性失活。本研究将采用交联酶聚集体(CLEAs)固定化技术,将酶进行有效的固定,应用到环境污染物TCP降解途径的构建中,并通过条件优化,提高TCP的降解效率。研究采用pBAD原核表达载体,通过条件优化,得到卤代烷烃脱卤酶、卤醇脱卤酶、环氧化物水解酶可溶性表达量分别为20%、50%、50%的高效表达体系,为实现应用CLEAs技术固定化酶奠定了基础。在已有的CLEAs固定化技术的基础之上,通过反应温度、添加剂、沉淀剂、交联剂、交联时间等条件优化,最终得到固定化卤代烷烃脱卤酶及固定化卤醇脱卤酶达90%以上的酶活保留,固定化环氧化物水解酶达50%以上的酶活保留。通过对最优条件下固定化卤醇脱卤酶的性能研究表明,CLEAs技术固定化酶具有较好的热稳定性、储存稳定性、有机耐受性、可回收利用性,对底物催化也具有较高的对映体选择性。因而该技术固定化酶具有较高的研究价值,可进一步应用于TCP多酶降解途径的研究中。TCP多酶降解途径中,对三种酶的添加顺序、添加比例及添加量进行了优化研究。结果表明:按反应先后顺序依次添加三种酶比同时添加得到的TCP的降解率高出14%以上;当添加三种酶比例为1:1:1时,得到的TCP降解效率最高;当添加酶的总质量为30 mg时,TCP的降解率最高,经过2h的反应,TCP降解效率可达到97%以上,并成功检测到甘油的生成。固定化体系经过5次反复使用后,TCP的降解率仍然可达75%以上。综上所述,本研究构建了一种基于多酶级联策略的高效TCP降解途径。