【摘 要】
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转录后m RNA的加工在肿瘤的发生和进展中发挥着关键的作用,其中就包括N6-腺苷酸甲基化（m~6A）修饰和选择性剪接。METTL3是一种重要的m~6A甲基化转移酶,它的上调会增加m~6A水平并对肝细胞癌（HCC）的发展产生显著影响。然而直到如今,METTL3的选择性剪接还没有被充分研究过,其剪接异构体的功能仍不清楚。在本课题研究中,我们发现了在HCC细胞系和组织中,除了存在全长的METTL3-A外
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转录后m RNA的加工在肿瘤的发生和进展中发挥着关键的作用,其中就包括N6-腺苷酸甲基化（m~6A）修饰和选择性剪接。METTL3是一种重要的m~6A甲基化转移酶,它的上调会增加m~6A水平并对肝细胞癌（HCC）的发展产生显著影响。然而直到如今,METTL3的选择性剪接还没有被充分研究过,其剪接异构体的功能仍不清楚。在本课题研究中,我们发现了在HCC细胞系和组织中,除了存在全长的METTL3-A外,还存在另外13个METTL3的剪接异构体。通过RT-q PCR验证,我们发现METTL3-D是表达截短METTL3蛋白的剪接异构体之一,在正常人肝脏中的水平高于METTL3-A,但在HCC肿瘤组织和细胞中的水平均低于METTL3-A。进一步的功能分析表明,METTL3-D的表达降低了细胞的m~6A修饰,抑制了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,并且与患者肿瘤的恶性程度呈负相关,表现出与全长METTL3-A相反的功能。TCGA数据的分析还表明,METTL3-D水平较高的HCC患者的生存时间更长。我们的研究表明,METTL3-D剪接异构体是一种肿瘤抑制因子,可能会成为未来HCC治疗的靶点。目的肝癌是一种常见的癌症,而HCC是肝癌中最常见的、死亡率很高的原发性恶性肝肿瘤。近年来的许多研究已经证明m~6A修饰在肝癌的诊断和治疗中发挥了重要作用。m~6A修饰由甲基化转移酶复合物催化,其中就包括了METTL3。尽管近年来METTL3得到了广泛的研究,但其剪接异构体的存在和功能尚未有文献报道。在本研究中,我们将鉴定和分析正常肝脏和HCC组织中METTL3剪接异构体。方法为了全面研究HCC中METTL3的剪接异构体,我们首先分析了HCC细胞系Hep G2的RNA测序数据,结合Ensembl数据库共确定了14种METTL3基因的剪接异构体。为了确认这些剪接异构体的存在,我们进行了RT-PCR、Sanger测序、三代测序,验证METTL3-A、-C和-D的存在。通过Western blot和q PCR检测比较METTL3剪接异构体在肝癌组织和正常组织中的表达水平。构建METTL3剪接异构体过表达的肝癌细胞,然后利用相关细胞分析技术来检测METTL3剪接异构体对肝癌细胞发展的影响;同时用细胞计数、CCK8、MTT来分析METTL3剪接异构体对肝癌细胞系增殖能力的影响。结果在HCC细胞系和组织中,除了存在全长的METTL3-A外,还存在另外13个METTL3的剪接异构体。通过RT-q PCR验证,我们发现METTL3-D是表达截短METTL3蛋白的剪接异构体之一,在正常人肝脏中的水平高于METTL3-A,但在HCC肿瘤组织和细胞中的水平均低于METTL3-A。进一步的功能分析表明,METTL3-D的表达降低了细胞的m~6A修饰,抑制了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,并且与患者肿瘤的恶性程度呈负相关,表现出与全长METTL3-A相反的功能。TCGA数据的分析还表明,METTL3-D水平较高的HCC患者的生存时间更长。结论1、在肝癌细胞系和肝癌组织中,除了存在全长的METTL3-A外,还存在另外13个METTL3的剪接异构体。2、METTL3-D在人类正常肝组织中的水平要高于METTL3-A,而在HCC细胞系和患者肿瘤中低于METTL3-A。3、METTL3-A促进m~6A修饰和下游靶基因m RNA的衰变和稳定性,而METTL3-D抑制细胞m~6A修饰并保护下游基因的m RNA衰变/稳定性。4、METTL3-D与HCC肿瘤的恶性程度呈负相关,与较长的患者生存时间呈正相关,与HCC细胞的生长、迁移和侵袭呈负相关。
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