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子宫内膜是动物体内一个特殊的免疫学部位,在妊娠期,它既保证具有同种异体移植物性质的胎儿不被排斥和营养需要,又保证母体不受胎儿抗原的损害和子宫局部不受病原的感染;由于内膜细胞直接与胚胎接触,是免疫-内分泌调节的中心,因此研究内膜细胞在局部免疫调节中的作用对于揭示上述平衡机制具有重要意义。原代培养细胞费时费力,花费高,且传代次数有限,细胞生理功能容易变异,造成不同试验结果间因细胞培养代数而难以比较,使许多研究工作受到限制。端粒酶是一种自带RNA引物的逆转录酶,它具有合成端粒DNA从而维持端粒长度并使体细胞得以无限制分裂的功能。本试验将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因分别导入山羊子宫内膜基质细胞(ESCs)和上皮细胞(EECs)中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定、生长特性及其对E2、P4的反应性测定以及潜在致瘤性的检测等。获得了以下结果:1.山羊子宫内膜经1.5 g/L胶原酶Ⅱ消化4 h,采用过滤-低速离心-自然沉降法分离单个细胞或成团细胞。分离的单个细胞接种培养0.5 h后开始贴壁,细胞呈梭形和三角形;波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性,纯度达95%以上。葡萄串状腺团接种培养12 h后开始贴壁生长,腺团向外部扩散,生长2～3 d,细胞扩散并出现明显的铺路石状,4～5 d腺团基本扩散开来;角蛋白表达阳性率达95%以上。2.将pCI-neo-hTERT真核质粒导入培养的二代山羊ESCs,加浓度为600μg/mL的G418筛选,14 d后浓度降至300μg/mL,继续筛选约4 d左右,得到抗G418的阳性克隆,传代扩大培养。转染ESCs呈现长梭形形态;免疫细胞化学检测波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,端粒酶催化亚单位显示阳性;PCR-ELISA法检测端粒酶活性阳性;转染ESCs目前已传至60代,表明外源性hTERT基因可以激活山羊ESCs的端粒酶活性从而使细胞永生化,将其缩写为hTERT-ESCs。3.hTERT-ESCs有正常的细胞增殖周期和接触抑制性;无裸鼠致瘤能力和软琼脂克隆能力;其同转染前ESCs具有相似的血清依赖性,在血清浓度较高的培养条件下增殖较快。用MTT法检测不同性腺激素对hTERT-ESCs的增殖作用,结果表明: E2/P4为100/0和100/10 nmol/L时对转染后细胞增殖作用较明显。4.将pCI-neo-hTERT真核质粒导入原代山羊EECs,加浓度为500μg/mL的G418筛选14 d后浓度降至250μg/mL,继续筛选约8 d左右,得到抗G418的阳性克隆,传代扩大培养。转染EECs呈明显铺路石状;免疫细胞化学检测角蛋白表达阳性,端粒酶催化亚单位显示阳性;PCR-ELISA法检测端粒酶活性阳性;目前已传至55代,表明外源性hTERT基因可以激活山羊EECs的端粒酶活性从而使细胞永生化,将其缩写为hTERT-EECs。5.hTERT-EECs有正常的细胞增殖周期和接触抑制性;细胞周期检测表明hTERT-EECs生长增殖较2代未转染细胞活跃;其细胞凋亡率低于2代未转染细胞;hTERT-EECs不具有裸鼠致瘤能力和软琼脂克隆能力;存在血清依赖性;hTERT- EECs存在雌、孕激素反应性,100 nmol/L的E2可促进该细胞的增殖,50nmol/L、100 nmol/L的P4可明显抑制该细胞的增殖。综上所述,本研究成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入山羊子宫内膜基质细胞和上皮细胞中,激活了其端粒酶活性,延长了细胞在体外培养的寿命,永生化的山羊ESCs和EECs仍能保持其正常的生物学特性和激素反应性。