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本论文研究工作源于国家自然基金项目-中药鸦胆子苦木素类成分抗胰腺癌的构效关系及作用机制研究(No.81773876)。本论文聚焦鸦胆子苦木素类成分,首先从鸦胆子中分离,纯化,鉴定苦木素类成分,然后通过MTT法检测苦木素类成分对胰腺癌的抑制活性,通过流式细胞术检测苦木素类成分对胰腺癌细胞凋亡的影响,利用免疫荧光技术检测苦木素类成分对胰腺癌细胞p38蛋白磷酸化影响,最后分别从增殖抑制,诱导凋亡以及促进p38蛋白磷酸化三个层面分析总结苦木素类成分的构效关系。论文分为三个章节,各章节的研究内容和主要结果归纳如下:一文献研究本章分为三节,第一节在天然苦木素类成分结构概述基础上,归纳总结了鸦胆子苦木素类成分的结构特征;第二节基于鸦胆子苦木素成分结构特征归纳总结了其核磁共振碳谱数据特征,为该类成分的结构鉴定提供快捷参考依据;第三节归纳总结了苦木素类化合物的抗癌活性及其构效关系。二鸦胆子苦木素类抗胰腺癌活性成分研究鸦胆子醇提物乙酸乙酯萃取部位经反复层析分离,纯化(硅胶柱色谱,凝胶柱色谱,C-18柱色谱,MCI柱色谱,正相中压制备色谱,反相中压制备色谱,高压制备色谱等)得到15个苦木素类成分,利用质谱,核磁共振等技术分别鉴定为bruceine B,bruceine A,bruceantarin,yadanziolide B,bruceantin,bruceantinol,bruceine J,brusatol,yadanziolide S,bruceine E,bruceine D,yadanzioside K,yadanziolide A,yadanziolide C,和 bruceoside A。三鸦胆子苦木素类成分抗胰腺癌活性评价及构效关系研究(一)鸦胆子苦木素类成分对胰腺癌增殖抑制评价利用MTT法检测纯化的苦木素类成分对四株胰腺癌细胞(MIA-PACA-2,ASPC-1,PANC-1,SW1990)的增殖抑制,确定了其对不同胰腺癌细胞的IC50值,结果显示苦木素类成分对四株细胞的作用趋势基本一致,其中MIA-PACA-2细胞株对苦木素类成分最为敏感,IC50低至0.007μM。Bruceine E,bruceine D,bruceine B,brusatol,bruceantarin,bruceine A,bruceantinol,bruceantin,yadanziolide A,yadanziolide C,yadanziolide B,yadanzioside K均具有较好的增殖抑制作用,IC50在0.07 μM～4.780 μM之间。其中brusatol,bruceine B,bruceine A,bruceantinol和bruceantin对细胞增殖抑制作用显著;yadanziolide S,bruceoside A和bruceine J对胰腺癌细胞无活性(IC50>50 μM)。基于增殖抑制活性及结构特征分析将苦木素类化合物抗胰腺癌活性的共性特征归纳为:A环中具有α,β不饱和烯酮结构;A环上的羰基位置影响活性,羰基在C-2位活性高,在其他位置活性降低;A环上有糖基取代会使活性降低或失去活性;C环的C-6位有羟基取代活性增强;C环的C-21位取代基形式影响活性;C环中有氧桥结构;D环的C-15位有酯取代基活性增强,且取代基的碳链不宜过长,在2-5个活性最好,取代基空间位阻太大会降低活性。(二)鸦胆子苦木素类成分诱导胰腺癌细胞凋亡作用评价及构效关系总结基于MTT实验筛选出13个有活性的苦木素成分,通过流式细胞术检测这些成分对MIA-PACA-2细胞凋亡情况的影响,发现苦木素化合物可呈剂量依赖性诱导MIA-PACA-2细胞发生凋亡,各化合物对细胞凋亡诱导的程度和细胞体外活性实验结果相似,说明苦木素类成分可能是通过诱导细胞凋亡抑制胰腺癌细胞增长的。其中化合物brusatol,bruceantin,bruceine B,bruceantinol,bruceine A,bruceine D和yadanziolide B对细胞的凋亡诱导作用最显著,而bruceine E对细胞的凋亡无明显诱导作用。苦木素类化合物诱导胰腺癌细胞凋亡的共性特征可归纳为:A环中具有α,β不饱和烯酮结构;A环中含羰基较不含羰基的凋亡诱导作用强;C环的C-6位有羟基取代会使凋亡诱导作用增强;C环的C-21位取代基亲脂性越强凋亡诱导作用越强;D环的C-15位含有酯取代基苦木素活性增强,但取代基空间位阻太大会降低活性;C-15位侧链氧化会降低苦木素对细胞的凋亡诱导作用。(三)鸦胆子苦木素类成分诱导胰腺癌细胞凋亡作用评价及构效关系总结利用Western blot法检测苦木素物质对MIA-PACA-2细胞中的p38蛋白磷酸化表达的影响。实验结果表明用化合物 brusatol,bruceine B,bruceantinol,bruceine D,bruceant可以使细胞中p38蛋白磷酸化的水平显著增高,其中brusatol对细胞p38蛋白磷酸化的促进作用最为显著。结合各化合物对胰腺癌细胞增殖抑制作用综合考虑,本实验结果提示促进p38蛋白磷酸化是一些苦木素类成分(如brusatol和bruceine D等)发挥抗胰腺癌作用的主要作用环节之一,而另一些高活性苦木素类成分(如bruceine A)则是通过其它潜在的环节发挥主要作用。苦木素类化合物促胰腺癌细胞p38磷酸化蛋白的共性特征可归纳为:A环中含有羰基或α,β不饱和烯酮结构;C环的C-21位取代基亲脂性越强促p38蛋白磷酸化作用越显著;D环的C-15位上含有酯取代基和不饱和双键苦木素活性增强;D环的脂肪链长度在2-5个适宜,且空间位阻太大会降低化合物活性。