高血压是一种常见的心血管疾病,是中风、冠心病等心血管疾病的主要危险因素。动脉压力感受性反射是维持机体血压稳态的重要机制,而高血压的形成与动脉压力感受器反射的重调或受损密切相关。孤束核(nucleus tractus solitarius,NTS)位于延髓背侧,是压力感受器反射的第一级中继站,对心肺活动的传入信息具有初步整合作用。业已证实,一氧化氮(nitric oxide,NO)在延髓多个神经核团发挥作用影响压力感受性反射的传出效应,并且NOS在NTS表达丰富。慢性间歇性低压低氧(Chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)处理可对机体多个器官和组织具有生物学保护作用,其心血管保护作用更加显著,通过改善血管内皮细胞功能,诱导NO合成和释放增多,舒张动脉血管,降低外周阻力,发挥降压作用。我们先前实验结果提示,CIHH可易化正常大鼠压力感受性反射,但CIHH是否重调高血压大鼠压力感受器反射及其中枢机制尚未揭示。本研究首次应用整体生理学、电生理学和分子生物学等方法、利用肾血管性高血压(renal vascular hypertension,RVH)大鼠模型,在NTS水平观察了CIHH是否通过NO信号通路影响压力感受性反射的传出效应,并探讨CIHH抗高血压作用的神经机制。本研究分为三部分:(1)利用肾血管性高血压大鼠模型,通过CIHH预处理观察其对压力反射传出活动的影响;(2)在肾血管性高血压大鼠上,探讨孤束核NO在CIHH易化压力感受性反射中的作用及其细胞机制;(3)在肾血管性高血压大鼠上,在NTS水平探讨Rho A/ROCK-NO信号通路是否介导了CIHH对压力感受器反射传出活动的效应。第一部分 慢性间歇性低压低氧对肾血管性高血压大鼠血压及压力反射性调控交感神经活动的影响目的:CIHH对大鼠压力感受性反射具有易化作用,提示CIHH的降压作用与压力感受性反射的易化有关。本部分研究旨在利用肾血管性高血压大鼠模型,确定CIHH对动脉血压以及压力反射性调控交感神经活动的影响。方法:成年雄性SD大鼠随机分为间歇性低氧处理组(CIHH)、肾血管性高血压组(RVH)、间歇性低氧加肾血管性高血压组(CIHH+RVH)和假手术组(SHAM)。RVH组大鼠通过两肾一夹方法制备肾血管性高血压模型。CIHH大鼠置于低压氧舱,接受28天相当于海拔5000m高度(每天6小时)的减压低氧处理,其余时间置于常氧环境。CIHH+RVH大鼠首先通过两肾一夹方法形成肾血管性高血压,手术后3周其血压升高达到稳定之后,给予28天相当于海拔5000m高度(每天6小时)的减压低氧处理。应用Powerlab数据采集分析系统记录肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity,RSNA)、动脉血压(BP)以及心率(HR)的变化。通过分别静脉注射nitroglycerin(25μg)减压和注射phenylephrine(10μg)增压刺激压力感受器观察反射传出活动改变,根据各组RSNA改变得到压力感受性反射曲线图,分析各实验组压力反射的异同。结果:1与SHAM和CIHH大鼠相比较,RVH大鼠及RVH+CIHH大鼠动脉收缩压明显升高(P<0.01)。RVH+CIHH大鼠接受四周CIHH处理后,动脉收缩压较RVH大鼠显著降低(P<0.01)。2与SHAM大鼠相比较,RVH大鼠血压-肾交感神经活动压力反射增益曲线下移(P<0.05)。CIHH大鼠增益曲线上移(P<0.05)。RVH+CIHH大鼠增益曲线较RVH大鼠向右上移位(P<0.05)。结果说明,压力反射性交感抑制反应在RVH大鼠减弱,在CIHH大鼠增强。3与SHAM大鼠相比较,RVH大鼠血压-心率压力反射增益曲线明显右下移位(P<0.01)。CIHH大鼠增益曲线稍向左下移位,但Gmax值无明显改变(P>0.05)。RVH+CIHH大鼠与RVH大鼠无明显差异,但心率明显降低。结果说明,压力反射性心率交感抑制反应在RVH大鼠减弱,在CIHH大鼠增强。小结:1 CIHH处理可明显降低肾血管性高血压大鼠的动脉血压。2肾血管性高血压大鼠压力反射性交感抑制反应明显减弱、压力感受性反射性功能受损;CIHH处理可增强压力反射性交感抑制反应、易化压力感受性反射,对抗高血压大鼠压力感受性反射功能受损。第二部分 孤束核NO在慢性间歇性低压低氧易化压力感受性反射中的作用及其细胞机制目的:前一部分研究表明,CIHH可增强压力反射性交感抑制反应,易化压力感受性反射,对抗RVH大鼠压力感受性反射功能受损,发挥抗高血压作用。本部分研究旨在利用肾血管性高血压大鼠模型,应用NTS微量注射、全细胞膜片钳和分子生物学等技术方法,从中枢水平探讨孤束核NO在CIHH易化压力感受性反射中的作用及其细胞机制。方法:通过脑内微注射方法,NTS微注射NO前体L-精氨酸(L-arg)、NOS抑制剂L-NAME、NO供体DEA/NO,c GMP类似物p CPT-c GMP,记录其对压力反射性调控的BP、RSNA和HR的影响。利用全细胞膜片钳技术,记录刺激同侧孤束(TS)诱发的NTS压力感受敏感神经元兴奋性突触后电流(e EPSCs)和自发兴奋性突触后电流(s EPSC)。应用L-arg和L-NAME观察内源性NO对NTS压力感受敏感神经元的电生理活动的影响;应用NO供体DEA/NO以确定L-arg作用是否由于NO合成减少所致;应用环磷酸鸟苷(c GMP)类似物p CPT-c GMP以确定L-精氨酸的作用是否与下游通路有关。应用Western blot方法测定各组大鼠NTS中n NOS和e NOS的蛋白表达。结果:1 NTS微量注射L-arg、L-NAME后,各组大鼠的BP、HR和RSNA均有所下降。RVH组大鼠BP、HR和RSNA下降幅度明显减小(P<0.05-0.01),CIHH大鼠下降幅度明显增大(P<0.05),RVH+CIHH大鼠下降幅度与SHAM大鼠无明显差异(P>0.05)。NTS微量注射DEA/NO后,各组大鼠的BP和RSNA均上升,RVH大鼠上升幅度最小(P<0.01),RVH+CIHH大鼠上升幅度较RVH组明显增大(P<0.01)。NTS微量注射c GMP类似物p CPT-c GMP后,各组大鼠的BP、HR和RSNA均下降,RVH大鼠下降幅度最高(P<0.05-0.01)。SHAM大鼠、CIHH大鼠和RVH+CIHH大鼠的下降幅度无明显差异(P>0.05)。结果说明,CIHH可通过增强NOS促进内源性NO合成,增强压力反射性交感抑制;外源性NO亦可促进CIHH对压力反射性交感抑制的增强效应;CIHH对压力反射性交感抑制的增强效应可能涉及NO以外的分子参与。2与SHAM大鼠相比较,RVH大鼠NTS压力感受敏感神经元e EPSC明显降低(P<0.01)。与RVH大鼠e EPSC相比较,CIHH大鼠与RVH+CIHH大鼠NTS压力感受敏感神经元e EPSC明显增加(P<0.01-0.05)。与SHAM大鼠相比较,RVH大鼠s EPSC频率明显增高(P<0.05);CIHH大鼠和RVH+CIHH大鼠NTS压力感受敏感神经元s EPSC频率较RVH组大鼠明显升高(P<0.05)。NO可增强CIHH对NTS压力感受敏感神经元e EPSC及s EPSC频率增强效应。结果说明,CIHH可通过NO增强NTS压力感受敏感神经元的电活动。3与SHAM大鼠相比较,CIHH大鼠NTS中n NOS和e NOS的表达明显增加(P<0.01),RVH大鼠NTS中n NOS和e NOS的表达明显降低(P<0.01)。RVH+CIHH大鼠n NOS和e NOS的表达较RVH组大鼠明显增加(P<0.05)。小结:1内源性NO及外源性NO诱发的压力反射性交感抑制在RVH大鼠明显减弱,在CIHH大鼠明显增强。2 NO可增强大鼠NTS压力感受敏感神经元e EPSC和s EPSC,此作用在RVH大鼠明显减弱,在CIHH大鼠明显增强。3 NTS内n NOS和e NOS表达在RVH大鼠表现下调,在CIHH大鼠表现上调。第三部分 Rho激酶在NO介导的NTS压力感受性调制中的作用目的:前一部分研究表明,CIHH通过NO途径提高NTS压力感受敏感神经元兴奋突触传递,增强NTS压力反射性交感抑制,发挥抗高血压作用。本部分研究将在此基础上,进一步探讨Rho A/ROCK通路在CIHH对NTS中NO信号调控中的作用。方法:通过脑内微注射方法,NTS微注射L-arg、L-arg+Y-27632和PTIO+Y-27632,记录其对压力反射性调控的BP、RSNA和HR的影响。利用全细胞膜片钳技术,记录刺激同侧孤束(TS)诱发的NTS压力敏感性神经元兴奋性突触后电流(e EPSCs)和自发的兴奋性突触后电流(s EPSC)。应用L-arg及L-arg+Y-27632,观察内源性NO和ROCK对NTS压力感受敏感神经元的电生理活动的影响。应用Western blot方法测定各组大鼠NTS中Rho A的蛋白表达。结果:1在RVH大鼠,ROCK抑制剂Y-27632 NTS微注射可加强NO前体L-arg诱导的血压、肾交感神经活动及心率的抑制反应(P<0.01);在CIHH大鼠,Y-27632可减弱L-arg诱导的血压、肾交感神经活动及心率抑制反应(P<0.01)。NO清除剂carboxy-PTIO可消除Y-27632对L-arg诱导抑制的作用(P<0.01)。结果说明,RVH大鼠NTS压力反射性交感抑制减弱可能与Rho A/ROCK激活有关,CIHH大鼠NTS压力反射性交感抑制增强可能通过抑制Rho A/ROCK激活所实现。此过程有赖于NO作用。2在RVH大鼠,ROCK抑制剂Y-27632可加强L-arg对NTS压力感受敏感神经元e EPSC的增强作用,减弱L-arg对s EPSC的增强作用(P<0.01);在CIHH大鼠,Y-27632可减弱L-arg对NTS压力感受敏感神经元e EPSC的增强作用,加强L-arg对s EPSC的增强作用(P<0.01)。结果说明,CIHH对NO介导的NTS压力感受敏感神经元兴奋性提高与ROCK抑制有关。3与SHAM大鼠相比较,RVH大鼠NTS中Rho A的表达明显增加(P<0.05),CIHH大鼠NTS中Rho A的表达明显减少(P<0.05);RVH+CIHH组大鼠NTS中Rho A的表达明显少于RVH大鼠(P<0.01)。小结:1 ROCK抑制剂Y-27632 NTS微注射可加强RVH大鼠L-arg诱导的血压、肾交感神经活动和心率交感抑制反应,减弱CIHH大鼠L-arg诱导的交感抑制反应。NO清除剂carboxy-PTIO可消除Y-27632对L-arg诱导抑制的作用。2 ROCK抑制剂Y-27632可提高RVH大鼠L-arg对NTS压力感受敏感神经元e EPSC的增强作用,减弱CIHH大鼠L-arg对e EPSC的增强作用;减弱RVH大鼠L-arg对NTS压力感受敏感神经元s EPSC的增强作用,增强CIHH大鼠L-arg对s EPSC的增强作用。3 RVH大鼠NTS中Rho A表达上调;CIHH大鼠NTS中Rho A表达下调。