前言肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，在很多城市发病率已居首位。早发现、早诊断和早治疗仍然是目前临床工作重点。但即使在美国这样的发达国家，早发现的患者只占21％。肺癌中大部分患者为非小细胞肺癌，因临床症状而就诊的非小细胞肺癌患者中，失去手术时机的晚期患者占50％以上。对这部分患者，放疗是主要的治疗手段之一。临床上常以CT检查作为监测放疗疗效的影像手段，但常规CT扫描作为一种形态学影像检查方法并不能很好地反映放疗前后肿瘤内部的血流动力学变化，而这对放疗前靶区勾画、治疗计划的制定及放疗后后续治疗方案的制定有着十分重要的临床意义。近年来，随着医学影像技术的发展，利用螺旋CT并借助一些特殊的软件技术，可早期发现肺肿瘤中血流变化情况。人们已经开始探索应用CT灌注成像评估肿瘤放疗疗效。本研究在建立兔VX2肺种植瘤模型的基础上，就CT灌注成像参数与肿瘤微血管密度及VEGF和MMP-2表达相关性进行研究。观察兔VX2肺种植瘤放疗前后CT灌注成像参数变化、肿瘤大小变化及肿瘤微血管密度变化，并就三者相互间的相关关系进行研究，以期为CT灌注成像成为肺部肿瘤放疗过程中疗效评估及预后判断中新的影像学手段提供实验依据。实验材料与方法1、设备、主要试剂、实验动物及VX2细胞系来源美国GE双排CT，GE lightspeed Ultra 16排螺旋CT扫描设备，AW4.1工作站Perfusion3软件，放疗采用美国瓦里安公司2100C／D直线加速器。欧乃派克(320mg I／ml)，CD34单抗(购自福州迈新公司)，抗VEGF和MMP-2抗体(购自武汉博士德公司)。SP9000免疫组化试剂盒(购自北京中山生物技术有限公司)。新西兰大白兔，体重(2.5±0.5)kg，雌雄不分，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。VX2鳞癌细胞株由中国医科大学第一医院介入放射科实验室提供。2、实验方案实验分为三部分第一部分采用悬液注射法、手术法和穿刺种植肿瘤法建立兔VX2肺种植瘤模型，观察不同模型实验兔生长情况，比较三种方法优缺点，找到一种相对理想的模型建立方法。第二部分入组11只实验兔，测定实验兔CT灌注参数及相应的VEGF和MMP-2及MVD计数情况，探讨三者相互间的相关性。第三部分实验首先探讨放疗后和自然情况下实验兔的CT灌注参数变化规律，放疗组入组4只实验兔，观察组入组5只实验兔，放疗组在治疗当天及放疗后第1、3、5、7、9、11及第13天分别行CT灌注检查，观察组也在相对应的时间点行CT灌注检查，根据放疗后CT灌注参数变化的实验结果，确定下一步实验设计中的观察时间点。把实验兔分为两组，治疗组和非治疗组，每组入组10只，测定治疗组在放疗当天及放疗后的CT灌注参数变化，肿瘤大小变化及MVD值，非治疗组也在相应的时间点测定上述指标。探讨CT灌注参数变化与放疗疗效及MVD变化的相关性。3、实验方法(1)CT平扫检查实验兔种植一周后，每两天检查一次。采用GE lightspeed Ultral 16螺旋CT。实验兔应用3％戊巴比妥钠溶液麻醉后，仰卧位固定于自制的固定架上，放于CT扫描床，定位扫描后，行胸腔平扫。CT平扫条件：扫描视野(Field of Volume，FOV)：11.9cm，电压：120KV，电流110mA，层厚2.5mm，共30～36层。(2)CT灌注及增强检查实验兔肿瘤长到7mm以上时，采用美国GE lightspeed Ultral 16螺旋CT扫描设备。将实验兔仰卧位固定于自制的固定架上，3％(1ml／kg)戊巴比妥钠麻醉，待麻醉成功，呼吸平稳后(呼吸节律控制在13～15次／分)，先行平扫，确定的肿瘤部位和范围，然后选择肿瘤组织中心层面，对肿瘤行多层同层动态灌注扫描。采用24GA一次性静脉留置针经耳缘静脉穿刺后，连接高压注射器静脉快速团注。行CT灌注扫描期间，应用腹带压迫，限制实验兔呼吸运动，同时给实验兔吸氧。注射前将对比剂加热至37℃，静脉穿刺尽量一次成功，注射方向与静脉回流方向一致。对比剂采用欧乃派克(320mgI／ml)，采用高压注射器(medrad—710)注射，流速0.3ml／s，总量2ml。CT灌注扫描条件：采用电影扫描技术(1r／0.5s)，层厚2.5mm，层间隔0：扫描范围：1cm，FOV11.9cm。扫描架无倾斜，大显示野，管电流60mA，管电压120kV。延迟6.3s，曝光时间50s，产生396(99×4)层的5mm重建图像，通过局域网传输至AW4.1工作站。在CT灌注扫描后5小时，再按上述流速注射相同剂量的造影剂，同CT平扫条件做CT增强扫描。(3)CT灌注图像后处理及分析将CT灌注图像传到AW4.1工作站，应用GE公司的Perfusion 3.0软件包进行计算，使其生成对指定类型的定量函数图和灌注参数，使用电影循环功能，快速连续显示图像。标识胸主动脉作为输入动脉，尺寸按2～6个象素放置，以避免部分容积效应问题。应用Perfusion 3软件处理获得反映肿瘤灌注功能状态的血流量(blood flow，BF)，血容量(blood volume，BV)及表面通透性(permeability surface，PS)，最大增强值(the maximum attenuation value，MAV)和伪彩功能图。为避免误差，测定灌注参数时，在肿瘤中心层面上勾画感兴趣区，使感兴趣区尽可能包括肿瘤但不超出肿瘤边缘。(4)三维立体适形放疗治疗计划的制定及实施待实验兔VX2肺种植瘤长到7mm以上，用3％(1ml／kg)戊巴比妥钠麻醉后将实验兔仰卧位固定于自制的固定架上，行CT定位。CT定位采用美国GE lightspeed Ultra 16排螺旋CT扫描设备，扫描完成后将CT图像传送到放射治疗工作站上，勾画靶区。放疗采用美国瓦里安公司2100C／D直线加速器，应用6MV的X射线，剂量率为2.18Gy／分钟。应用Cadplan治疗计划系统，设计出4个非共面拉弧野。肿瘤组织受照剂量为20Gy。(5)组织学检查及结果判定CT灌注扫描后1小时内处死实验兔，兔肺标本常规用10％中性福尔马林脱水，石蜡固定，4μm厚切片(组织切片与CT所选层面一致)。行HE染色及免疫组化检查。主要实验步骤参照试剂盒说明书进行。微血管密度(microvascular density，MVD)计数：MVD定义为单位面积组织切片内CD34染色阳性的微血管细胞数。肿瘤内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞族代表1条单独的微血管。先在低倍镜下(100X)浏览全片，避开坏死区域，找出微血管密度大的“热点”(hot spot)，换高倍镜(200X)，每张切片记录5个“热点”，取其平均数作为该病例的MVD。VEGF免疫组化染色阳性结果判断：肿瘤细胞胞浆、胞核内出现棕黄色颗粒，血管内皮细胞也可见到阳性染色，随机选取5个高倍镜视野，计每个视野100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞百分率，取其平均值。MMP-2免疫组化染色阳性结果判断：肿瘤细胞胞质、血管内皮或间质中出现棕、黄色颗粒或团块。随机选取5个高倍镜视野计每个视野100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞百分率，最后取其平均值。胞质内无棕黄色颗粒的细胞为MMP-2阴性细胞。(6)统计学分析所有数据用SPSS12 for windows统计软件包做分析处理，所有计量资料以均数±标准差来表示。不同组别之间的参数比较采用t检验，相关分析采用Pearson法。p＜0.05被认为有统计学意义，p＜0.01被认为有显著统计学意义。结果1、VX2肿瘤种植后实验兔生长情况种植后10天～20天，实验兔开始出现厌食，精神不振，活动，觅食减少，毛发光泽度下降。悬液注射法肺成瘤率为100％(13／13)，种植后三周观察，胸膜、膈肌及肺门淋巴结均有肿瘤生长，肺内肿瘤数量为5～15个。平均生存时间为(38±3)d。手术法成肺瘤率为64.3％(9／14)，种植后三周观察，肺门淋巴结有肿瘤生长，肺内仅出现1个肿瘤。实验兔平均生存时间为(46±5)d。穿刺种植肿瘤法肺成瘤率为84.6％(11／13)，种植后三周观察，肺门淋巴结有肿瘤生长，肺内仅出现1个肿瘤。实验兔平均生存时间为(54±5)d。与悬液注射法相比，手术法和穿刺种植肿瘤法实验兔生存期明显延长。与手术法相比，穿刺种植肿瘤法种植成功率明显提高，实验兔生存期亦明显延长。2、CT平扫和增强扫描结果CT平扫肿瘤呈椭圆形或不规则形，CT值：43.27±5.59Hu。增强CT见肿瘤多呈均匀强化，CT值：112.27±22.78Hu，其中3例肿瘤直径大于11mm值，肿瘤内有坏死，造成不均匀强化。3、CT灌注检查结果兔VX2肺种植瘤CT灌注图像质量良好，在BF和BV图中瘤区血供极丰富，在伪彩图上为红色。瘤周区血供较正常肺组织也有所升高，为红色。PS图显示病变最清楚，瘤区PS值有明显升高，在伪彩图上为红色，瘤周区PS值较正常肺组织升高，但较肿瘤区为低，在伪彩图上为绿色。PS图上显示的病变范围与CT增强图像显示的病变范围近似，而BF和BV图上显示的病变范围比CT增强图像显示的病变范围要大。4、CT灌注参数与MMP-2，VEGF表达及MVD计数相互间的相关性分析Pearson相关分析表明：肿瘤实质区CT灌注参数MAV、BF、BV和PS与VEGF表达呈正相关；肿瘤实质区CT灌注参数MAV、BF、BV和PS与MVD呈正相关；MVD与VEGF表达亦呈正相关；肿瘤实质区PS值与MMP-2表达呈正相关；MVD及VEGF表达与MMP-2表达无相关性。5、放疗对CT灌注参数、肿瘤大小及MVD变化的影响治疗组实验兔放疗后1周和非治疗组实验兔单纯饲养1周后相比，肿瘤大小具有显著差异，治疗组实验兔肿瘤明显小于非治疗组，P＜0.01。治疗组实验兔放疗后1周与非治疗组实验兔单纯饲养后1周相比，治疗组实验兔瘤区BF、BV、MAV值和PS值均明显低于非治疗组，P值均小于0.01，有显著差异。治疗组放疗1周后所测的MVD计数为48±9，非治疗组在单纯饲养1周后所测的MVD计数为73±8，两者存在明显统计学差异，P＜0.01。Pearson相关分析表明：放疗与否肿瘤实质区BF、BV和MAV值变化与MVD计数变化呈正相关，P＜0.05，放疗与否肿瘤实质区PS变化与MVD计数变化无相关性；放疗与否肿瘤大小变化和MVD计数变化，BF值和MAV值变化与肿瘤大小变化亦呈正相关，放疗与否肿瘤大小变化与PS和BV值变化无相关性。结论1．与悬液注射法和手术法相比，穿刺种植肿瘤法建立的兔VX2肺种植瘤模型更为稳定，实验兔生存时间更长，更有利于实验的顺利进行。我们认为穿刺种植肿瘤法建立的兔VX2肺种植瘤模型能够为肺部肿瘤诊治提供稳定可靠的实验研究基础。2．CT灌注参数不仅能反映兔VX2肺种植瘤微血管生成情况，而且可反映VEGF和MMP-2表达情况，表明VEGF和MMP-2在兔VX2肺种植瘤微血管生成和转移播散中发挥了重要作用。3．兔VX2肺种植瘤经X刀治疗后，免疫组化CD34染色观测肿瘤MVD较非治疗组明显减少。与非治疗组相比，瘤区CT灌注参数BF、BV、PS和MAV值均下降，做BF、BV和MAV值变化与肿瘤MVD变化的相关性检验，结果均显示出相关性。表明CT灌注参数BF、BV和MAV值可作为与组织学MVD相对应的，一种活体评价放疗前后肿瘤微血管生成和灌注情况变化的指标。4．与非治疗组相比，治疗组放疗后肿瘤明显缩小。做治疗组与非治疗组实验兔肿瘤大小变化与BF和MAV的相关性检验，结果均显示出明显相关性。说明可通过放疗前后CT灌注参数BF和MAV值变化，预测肿瘤放疗效果，同时说明CT灌注成像技术在肿瘤放疗计划制定和疗效监测的作用值得进一步深入研究。