【摘 要】
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克痛宁(α-Cobratoxin)是一种来源于眼镜王蛇毒腺的神经毒素,含72个氨基酸残基,空间结构为三指环形,具有与神经肌肉接头的N-型乙酰胆碱受体(nAChR)结合的活性;常用来作为研究
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克痛宁(α-Cobratoxin)是一种来源于眼镜王蛇毒腺的神经毒素,含72个氨基酸残基,空间结构为三指环形,具有与神经肌肉接头的N-型乙酰胆碱受体(nAChR)结合的活性;常用来作为研究AChR结构、功能及其相互关系,以及研究神经传导和离子通道等的工具。同时克痛宁也具有较高的医用价值,如治疗重症肌无力,并且有良好的镇痛、戒毒和抑瘤作用等。但由于眼镜王蛇属于国家二级保护动物,采用杀蛇取毒的方法药源受到限制,不能满足市场需求,因此我们采用基因工程的方法来生产克痛宁。 本研究选用了巴斯德毕赤酵母作为基因表达系统,受体菌为GS115菌株,分泌型质粒pPIC9为载体,构建重组质粒pPIC9k/HIP,线性化后,电击法转化巴斯德毕赤酵母,筛选出his~+Mut~s表型阳性克隆菌株GS115-CBT 18株。在此基础上,进一步利用重组菌对G418抗性的差异筛选出了具有不同外源基因拷贝数的菌株,并成功表达了克痛宁前体。小试样品经分离纯化后获得了少量克痛宁前体样品,肠激酶酶切后用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳进行分子量分析,结果表明所设计的克痛宁基因在毕赤酵母中获得了正确的表达。 为了适应工业化生产,本文还对菌种生长及诱导表达条件进行了探索优化。针对发酵过程中对产量影响较大的因素进行了正交实验分析,得出了最佳培养条件:pH值6.0,微量元素为7.5mL/L,硫酸铵浓
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