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目的：
CD40 ligand(CD40L，CD154)是Ⅱ型膜糖蛋白，分子量约39KDa，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族。CD40L短暂表达于活化的CD4+T 细胞表面。它的天然受体是CD40，主要选择性地表达于上皮肿瘤细胞、间叶肿瘤细胞、造血前体细胞、所有的抗原递呈细胞(APC)、活化的单核细胞和B淋巴细胞等。CD40L和CD40之间相互作用在免疫系统应答过程中起着重要作用。对于免疫细胞，CD40-CD40L结合可以活化抗原递呈细胞，上调共刺激分子表达，调节T细胞激活和T细胞介导的效应功能并参与慢性炎症疾病的病理过程，促进B细胞成熟和免疫球蛋白类别转换；对于肿瘤细胞，CD40L信号可以抑制恶性B淋巴细胞、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞癌生长，其机制可能是通过细胞周期阻断和/或诱导凋亡产生。CD40L的抗肿瘤效应在于一方面可以通过活化APC增强体内肿瘤免疫排斥应答，一方面可以通过上调上皮细胞表达共刺激分子和细胞因子增强肿瘤的免疫源性。原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，除手术切除外对放疗和化疗多不敏感，因此免疫治疗和基因治疗一直是肝癌治疗领域中的一个研究重点。鉴于CD40L，具有调节免疫和抗肿瘤的双重效应，结合近年有关RNA疫苗方面的成就，我们构建了人CD40L基因真核表达质粒，并将其转染人肝癌细胞系HepG2细胞，检测CD401L对HepG2细胞杀伤效应并探讨其机理；另一方面，应用CD40L在体外扩增B淋巴细胞，并用HepG2细胞及人肝癌原代培养细胞的总RNA转染B淋巴细胞，建立了CD40-B/RNA 技术，在体外研究其对肝癌细胞的杀伤作用，探讨此种新型疫苗在肝癌免疫治疗中的优势，为肝癌的主动特异性免疫治疗探索一条新的途径。
方法：
人CD40L基因真核表达质粒的构建：从植物血凝素(PHA)活化的人外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA，通过RT—PCR扩增人CD40L cDNA并插入BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ酶切位点。分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切CD40L cDNA和pcDNATM3.1/myc—His(—)A后连接两者，转入大肠杆菌E．coli DH5α筛选并扩增重组质粒。经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、Bel Ⅱ和EcoR Ⅰ双酶切以及Hind Ⅲ酶切初步鉴定后，进行序列测定并于PubMed基因数据库进行序列对比。将成功构建的人CD40L cDNA真核表达载体稳定转染入人肝癌HepG2细胞中。转染分4组，A组HepG2细胞转染重组质粒，B组HepG2细胞转染不含CD40L cDNA的空质粒，C组和D组HepG2细胞正常培养。48 h后A，B，D组细胞加入G418加压筛选，C组细胞继续单纯培养。RT—PCR及流式细胞术鉴定A，B，C 3组细胞表面CD40L和CD40的表达。A，B，C 3组细胞分别设6个复孔培养72h后，流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达。分别取健康成人和HCC病人外周静脉血，经淋巴细胞分离液分离PBMC，在CD40L和IL—4的诱导下活化产生B淋巴细胞(CD40-B)，流式细胞术鉴定其表面分子，ELISA 法测定B细胞产生的IL-12。Trizol抽提HepG2细胞及原代培养的肝癌细胞RNA，鉴定后电转染CD40-B，将其诱导PBMC产生CTL，流式细胞仪鉴定CTL表面CD8分子，用ELISA法测定CTL产生的IFN—γ，混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytereaction，MLR)测定CTL的增殖，MTT法测定CTL对HepG2细胞及原代培养的肝癌细胞的杀伤效应。
结果：
测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L—pcDNATM3.1/myc—His(—)A构建成功。流式细胞术检测A组HepG2细胞表面高表达CD40L，B和C组细胞表面仅有CD40表达。A组细胞凋亡率升高，B，C组均未发生明显凋亡(P＜0．01)。与C组细胞比较，A组细胞周期分布主要阻滞在G0/G1期(P＜0.01)，S期和G2/M期分布均有减少(P＜0.01)。A组细胞Fas表达率较B组和C组明显上调(P＜0.01)。在CD40L的作用下，B淋巴细胞呈克隆样增殖，并高表达表面分子CD80/CD86和CD19，分泌IL-12增多(P＜0.05)。HepG2细胞及原代培养的肝癌细胞总RNA转染的CD40-B均可以诱导产生CTL，该途径产生的CTL表面高表达CD8分子，高分泌IFN—γ(P＜0.05)，其杀瘤活性明显升高。
结论：
以上结果表明我们构建的人CD40L 基因真核表达质粒CD40L—pcDNATM3.1/myc—His(—)A序列正确，没有发生点突变，并可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达。稳定表达CD40L的HepG2细胞CD40表达减少，细胞周期阻滞在G0/G1期，Fas表达上调，由Fas/Fasl 凋亡通路最终导致HepG2发生凋亡。我们的研究揭示CD40L对于HepG2细胞具有直接生长抑制作用，这可能与CD40L—CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调引发的凋亡和细胞周期阻滞有关。CD40L可以在体外大规模扩增、活化B淋巴细胞，以此作为抗原递呈细胞，负载HepG2细胞及原代培养的肝癌细胞总RNA，可在体外诱导产生特异性CD8+CTL，这些都将为HCC提供一种可能有效的疫苗治疗方法。