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间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有自我增殖和分化潜能的多能干细胞,最初在骨髓中被发现,是干细胞家族的重要成员。MSCs可以向多种中胚层和外胚层组织分化,可以逃避机体的免疫监视。在组织工程中被认为是一种具有临床应用价值的种子细胞。丝素蛋白(silk fibroin, SF)是复合蛋白,由H链(分子量350 kDa)、L链(分子量25.8 kDa)及P25糖蛋白(分子量28 kDa)组成,三者比例为H:L:P25=6:6:1。丝素蛋白本身的蛋白质结构能提供多个位点来进行生物大分子修饰。有研究表明将RGD([Arg - Gly -Asp])肽引入丝蛋白膜表面能显著提高材料的骨诱导性。人类成骨细胞、内皮细胞和上皮细胞等均能在家蚕丝素蛋白材料上较好地黏附生长。羟基磷灰石[Ca10(P04)6(OH)2,HA]的分子结构及其钙/磷比与正常骨的无机成分非常近似,具有优异的生物相容性。大量的体外和体内实验表明羟基磷灰石在与成骨细胞共同培养时,羟基磷灰石表面有成骨细胞聚集;植入骨缺损部位时,骨组织与羟基磷灰石之间无纤维组织界面;植入体内后有表面类骨磷灰石形成,表明羟基磷灰石具有骨诱导性。本实验采用丝素和丝素混合羟基磷灰石材料作为研究对象,联合鼠源间充质干细胞和人胎盘源间充质干细胞展开以下两部分研究。本实验共分为两个部分,第一部分主要检测了SF多孔材料和SF/HA复合多孔材料的体外细胞相容性。首先采用小鼠的间充质干细胞接种在SF铺板,SF混合HA铺板和对照塑料板上,培养5d,采用MTT法检测细胞活性。然后将小鼠的间充质干细胞接种在3%浓度SF多孔材料、6%SF浓度多孔材料、400%NaCl加入量SF/HA复合多孔材料、600%NaCl加入量SF/HA复合多孔材料,培养5d,采用MTT法检测细胞活性。并通过拍摄扫描电镜照片检测细胞在材料上面的粘附生长情况以及细胞的增殖效果。平面铺板各组的检测结果显示,SF铺板和SF/HA铺板组细胞活性均比对照组高。而多孔材料组的MTT检测结果显示SF多孔材料组细胞活性均比SF/HA多孔材料组高,3%SF多孔组与6%SF多孔组没有明显区别,而600%NaCl加入量SF/HA复合材料组细胞活性比400%NaCl加入量SF-HA复合材料组高。在4组多孔材料中,小鼠间充质干细胞C3H10T1/2均可以很好地生长黏附并大量增殖,并可见有胞外基质分泌,可见4组多孔材料体外细胞相容性良好。同时双层SF/HA材料在细胞培养过程中粘附良好,保持了很好的物理状态。第二部分检测各材料组接种人胎盘源间充质干细胞诱导成骨的效果。首先进行原代人胎盘来源间充质干细胞(PMSCs)的培养,并对其分化能力进行鉴定。胎盘组织经Ⅳ型胶原酶消化、贴壁和传代培养可获得人PMSCs,运用倒置显微镜和流式细胞仪检测进行细胞形态和表型的鉴定,证实已成功培养得到PMSCs。然后将细胞接种在四类多孔材料上,分设三个实验组,一组以成骨诱导培养基培养,一组以完全培养基培养。另设一组空白对照,仅放置材料,不接种细胞。每三天换液一次,培养15天。换液时收集细胞培养上清,检测碱性磷酸酶(ALP)活性。培养15天后,分别检测四组多孔材料中细胞的ALP活性。成骨诱导组ALP活性检测结果显示,600%NaCl加入量SF/HA与6%SF支持成骨诱导效果明显好于400%NaCl加入量SF/HA与3%SF。未诱导组检测结果显示,四组多孔材料ALP活性与对照组无明显区别。这一结果显示人PMSCs未出现自发成骨分化,表明在体外实验中SF/HA材料对人胎盘源间充质干细胞没有成骨诱导作用。综上所述,两组丝素多孔材料和两组丝素/羟基磷灰石材料都具有良好的体外细胞相容性。6%SF和600%NaCl加入量SF/HA复合材料在诱导人PMSCs成骨实验中比其他两组材料效果好,从而选择以上两种生物材料进行后续的体内动物实验,为丝素蛋白及其复合材料在组织工程中的应用提供进一步的理论依据。