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幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因素,目前的治疗手段主要是应用抗生素治疗的三联疗法和四联疗法,但是随着菌体抗生素抗性的增加,治愈率明显降低,免疫治疗可能是有效防治幽门螺杆菌感染最有前景的方法之一,幽门螺杆菌疫苗的研制已经成为目前研究的热点。家蚕生物反应器主要是利用家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白,因其低成本、高表达量、产物天然性好而著称。本文旨在利用家蚕生物反应器表达CTB免疫佐剂和幽门螺杆菌UreB抗原融合蛋白,并对其免疫原性进行研究,为利用家蚕生物反应器低成本生产幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础。
首先,对重组杆状病毒BmNPV-UreB中ureB基因进行了序列测定,SDS-PAGE和Western blotting分析显示重组病毒在家蚕BmN细胞、幼虫和蚕蛹中能稳定表达;利用AKTA explorer10蛋白纯化系统对家蚕幼虫血淋巴中的UreB蛋白进行阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,经双向电泳进一步分离后进行了质谱鉴定。其次,采用原核表达系统表达了CTB蛋白,GM1亲和活性分析表明表达的CTB蛋白具有较好的GM1亲和活性,可以作为口服免疫佐剂。第三,利用Bac-to-Bac系统构建了重组病毒BmNPV-(CTB-Linker-UreB),对CTB和ureB基因进行了融合表达,SDS-PAGE和 Western blotting分析显示重组杆状病毒在家蚕BmN细胞和蚕蛹中成功表达;利用抗体亲和层析对蚕蛹表达的CTB-Linker-UreB融合蛋白进行了纯化并进行了质谱鉴定。最后,用蚕蛹表达的CTB-Linker-UreB融合蛋白灌胃ICR小鼠探讨了该融合蛋白的口服免疫原性。实验结果显示,融合蛋白能够明显诱导小鼠产生血清IgG,表明融合蛋白具有较好的免疫原性,可以作为生产幽门螺杆菌口服疫苗的候选抗原蛋白。