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γ-氨基丁酸是大脑中抑制性递质的一种重要成分,在神经信号传递中起着重要作用。除脑组织外,丫-氨基丁酸及其受体还存在于多种外周组织中。γ-氨基丁酸的受体有A、B、C三种类型,其中A、C属于门控C1-通道,B型受体是代谢型受体,属于G蛋白偶联家族。兀亚基（GABRP）是发现的一种新型的A型受体亚基。目前对GABRP在癌组织中研究较多,发现它能调节肿瘤细胞的增殖和迁移,但有关其在外周内分泌组织中的作用研究较少。在乳腺组织中,GABRP主要与乳腺癌细胞的迁移有关,几乎没有与乳腺上皮细胞增殖分化方面的研究。课题组前期研究发现,GABRP基因是Stat5a下游的一个靶基因,GABRP基因的表达在小鼠妊娠后期显著升高,推测尢亚基在乳腺发育以及泌乳方面发挥着重要的作用。本课题通过研究GABRP基因对水牛乳腺上皮细胞增殖以及泌乳相关基因表达的影响,在细胞水平上初步了解π亚基的功能,研究结果为进一步了解水牛乳腺细胞的生长规律及泌乳机制奠定基础。1.水牛GABRP基因的克隆及其在乳腺组织中的表达分析。以GenBank数据库中牛的GABRP （NM001015618.1）为参考序列设计合成特异性扩增引物,以水牛乳腺组织总RNA为模板,应用RT-PC R技术扩增水牛GABRP基因的cDNA序列,结果显示,获得的片段与河流型水牛GABRP基因序列的同源性为99.4%,说明克隆得到了水牛的GABRP基因；应用QRT-PCR技术检测不同时期水牛乳腺组织GABRP基因的表达,结果显示,GABRP基因在泌乳期和非泌乳期乳腺组织中都有表达,且非泌乳期的表达量要显著高于泌乳期（P<0.05）；应用免疫组化技术对GABRP蛋白在泌乳期水牛乳腺组织进行定位分析,结果显示,GABRP蛋白主要在乳腺组织的腺泡上皮中表达。2.水牛乳腺上皮细胞的分离纯化鉴定。从屠宰场取回新鲜的泌乳期水牛乳腺组织,利用组织块贴壁法和胰蛋白酶消化差异法分离纯化水牛乳腺上皮细胞,并用免疫荧光染色技术鉴定乳腺上皮细胞特异性骨架蛋白—角蛋白18。结果发现,组织块贴壁法可分离得到乳腺上皮细胞,纯化的乳腺上皮细胞表达角蛋白18,并且具有正常的增殖能力。3.不同浓度GABA、GAB A A受体激动剂muscimol处理对水牛乳腺上皮增殖和泌乳相关基因表达的影响。在水牛乳腺上皮细胞培养液中分别加入50μm/L、100μm/L,500μm/L的GABA,0.5μm/L、5μm/L、50μm/L的muscimol, CCK8试剂盒检测乳腺上皮细胞的增殖情况；流式细胞仪检测不同浓度GABA和muscimol处理对水牛乳腺上皮细胞周期的影响对水牛乳腺上皮细胞周期的影响；QRT-PCR技术检测添加GABA和muscimol对细胞周期蛋白Cyclin1、GABRP 以及 mTOR, FABP3、GLUT等泌乳相关基因表达的影响。结果发现,GABA、muscim ol能显著抑制水牛乳腺上皮细胞的增殖（P<0.05）,且抑制效率与GABA、muscimol的浓度及处理时间有关。不同浓度的GABA和muscimol处理均能增加G1期细胞比例,降低S、G2期细胞的比例；不同浓度GABA和muscimol处理均能能显著降低CyclinDl和GABRP基因的表达量（P<0.05）,对mTOR、 FABP3、GLUT1等泌乳过程中的关键基因的表达量有不同程度的影响（P<0.05）。以上结果表明,GABA通过GABAA受体的π亚基（GABRP）参与了乳腺发育及泌乳调控过程。