研究背景癫痫(Epilepsy)是大脑神经元异常放电,导致反复发作的大脑功能障碍的一种慢性疾病。其发病率高,病程长,对家庭及社会的影响大。离子通道的活动是神经系统电兴奋性的基础。电压依赖性钠离子通道(Voltage-gated sodium channels, VGSCs)在脑兴奋过程中发挥重要的作用,主要负责神经元动作电位的产生与传导。VGSCs是由1个260 kD的α亚基和1个或多个33~36 kD的β亚基(β1-β4)组成的蛋白复合物,其中α亚基组成VGSCs的主要部分,是VGSCs的功能性亚基[1,2]。目前发现了九个α-亚基异构体,其中Nav1.4在骨骼肌中表达, Nav1.5在心脏表达,Nav1.7、1.8和1.9在感觉神经元中表达,Nav1.1,1.2、1.3和1.6主要分布在中枢神经系统(Central nervous system, CNS)[3,4]。VGSCs功能异常所导致的离子通道病是目前为止人类最常见的通道病,已被证实与癫痫、孤独症及偏头痛等多种神经系统疾病相关。世界卫生组织估计全球有超过5000万人正在承受着癫痫所带来的痛苦。现有的第一、二代抗癫痫药物中,卡马西平、苯妥英钠、拉莫三嗪等,均通过作用于VGSCs,在一定程度上控制癫痫的发作。但是,由于它们作用机制广泛,长期大量服用控制患者发作的同时,都存在一定的毒副作用[7,8]。因此发展出特异性强,安全,耐受性好的抗癫痫药物符合广大癫痫患者的迫切需要。现阶段抗癫痫药物已开发至第三代,大多数开发中的第三代抗癫痫药物都能够特异性的作用于VGSCs的α亚基或β亚基,为VGSCs的阻断剂,它们特异性好,主要是通过抑制钠通道的功能,从而抑制钠电流,进而抑制神经元的异常放电,以达到治疗癫痫的目的[9,10]。其中近期通过美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)验证允许上市的第一例第三代抗癫痫药物拉科酰胺,就是通过特异性作用于VGSCs的慢失活通道而起作用[11]。由于它们作用强,安全,耐受性好,第三代抗癫痫药物具有广泛的开发与应用前景。有文献指出引起部分性癫痫伴热性惊厥附加症(Partial epilepsywith febrile seizure plus,PEFS+)、全面性癫痫伴热性惊厥附加症(Generalized epilepsy with febrile seizure plus,GEFS+)、重症婴儿肌阵挛性癫痫(Severe myoclonic epilepsy in infancy, SMEI)等不同类型癫痫的原因分别与不同位置的VGSCs基因突变导致的钠通道蛋白功能的不同改变密切相关。电生理研究初步证实:细胞中表达钠通道突变改变了正常的钠电流,导致神经元兴奋性改变而致病,这为研究癫痫发作的机制提供了更多的依据。由于产生癫痫的原因复杂,针对癫痫发病机制选择对症药物,才能够实现个体化给药,达到最好的疗效。近年来我国中药产业面临着巨大的发展机遇,国家政策规划要求不断丰富和完善中医药理论体系,加大对中药研发的投入力度,大力发展具备自主知识产权的优秀中药制剂。但相较于成分确定的单体化合物为主的西药,现阶段广大中药面临着成份复杂,作用机制不明确等问题,难以被规范、科学的现代医疗理念所认同,中药提取单体并阐明作用机制,最终获得国际学术界认可,是中药成药的发展趋势。伊来西胺,又名3,4-亚甲基二氧肉桂哌啶,或名3-(3,4-亚甲基二氧苯基)丙烯酰哌啶,曾用名抗痫灵(AES),为胡椒嗪的衍生物之一,是一种新的抗癫痫药物。我国对伊来西胺有着完全的知识产权,它是获得国际公认的纯植物中药成果。基于动物模型的药理实验证明,其抗癫痫作用显著。临床结果表明:作用于整体小儿癫痫,伊来西胺与安慰剂比较无显着差异;但伊来西胺对强直-阵挛发作有显著疗效,强直-阵挛发作是癫痫发作最常见的类型。在伊来西胺有效及无效组中进行比较发现,血液中药物水平没有显著性差异。伊来西胺是一个较为安全的药物,药品原料日常可食用,儿童给予10毫克/公斤/天的大剂量治疗没有显示严重的副作用。临床认为,伊来西胺有可能改善病人的心理和认知状况。北大医院曾经临床应用于超过10万患者,结果表明伊来西胺有效率为95.6%,综合显效率83.3%。伊来西胺成份单一,治疗效果良好,毒副作用轻微,但一直以来对其抗癫痫机制的研究甚少。通过临床观察曾经认为,伊来西胺可能的抗癫痫机制有:1,平衡细胞电荷,阻止异常放电。伊来西胺进入大脑分解后,直达脑神经病变部位,平衡细胞内外钾、钙离子电荷水平,消除细胞异常流动,达到阻止大脑异常放电的目的。2,稳定递质代谢,控制癫痫症状。伊来西胺可平衡传递大脑指令的神经递质代谢,有效阻断错误指令的传输,从而控制癫痫发作症状。3,修复神经细胞,恢复患者智力。伊来西胺还可以直接参与细胞合成,增强脑细胞携氧能力,修复脑神经损伤,逐步恢复指令的正常传导,从而恢复患者智力。但伊来西胺以上作用机制仅限于假说和推测,尚无明确结论,难以满足现代社会对安全、有效药物的要求。FDA就要求上市的新药必须拥有明确的分子水平的作用机制。受限于此,伊来西胺作为抗癫痫药物的影响非常有限,且影响仅限于国内——这也是大多数优秀中药的悲哀。因此,从分子水平研究伊来西胺的作用机制符合现代医药的要求,是伊来西胺以及所有中药的推广和使用所不可或缺的。现今人们了解到神经元放电与离子通道、尤其是钠离子通道有关,癫痫发生与VGSCs的关系成为了当下研究的重点,VGSCs的功能改变导致癫痫易感,调节VGSCs的功能能够减少癫痫发作。因此伊来西胺对VGSCs的作用可能是其抗癫痫的机制之一。研究目的和内容在急性分离的FVB品系WT小鼠海马锥体神经元中加入不同浓度的伊来西胺,观察不同浓度伊来西胺对小鼠海马锥体神经元钠电流的影响,同时观察在不同钳制电压下给予伊来西胺对小鼠海马锥体神经元钠电流的影响。通过探讨不同的浓度与钳制电位下钠电流的电生理学变化,有助于进一步认识伊来西胺的抗癫痫作用的分子机理,规范其正确适用范围,探讨其使用剂量,使伊来西胺这一中国拥有完全知识产权的抗癫痫药物拥有更广泛的应用前景。给其他广大中药制剂提供一个可供参考的研究模式。研究方法1.饲养并繁殖FVB品系WT小鼠FVB品系WT小鼠饲养在19～21℃自然光条件下,自由获取食物和水分。选取10-17天龄的WT鼠,一般选取雄性小鼠。2.采用急性分离技术分离小鼠海马锥体神经元腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉动物,快速断头取脑,分离出海马,切为350um厚的脑片,在人工脑脊液中孵育1小时,再加胰酶消化18分钟,用HSSB清洗后置入HSSB中孵育1小时,而后用Pasteur吸管吹打脑组织,使细胞游离,最后置入覆有0.05%多聚赖氨酸的载玻片上。使游离的海马锥体神经元贴壁后等待下一步膜片钳实验。3.免疫荧光标记观察锥体神经元上VGSCs的分布多聚甲醛灌注小鼠,冰冻切片,做锥体神经元细胞免疫组化,统计细胞数目,并孵育Nav1.1的抗体以及相应二抗,在荧光显微镜下观察锥体神经元上Nav1.1的表达。4.采用全细胞记录膜片钳技术检测钠电流特征使用全细胞记录膜片钳技术检测伊来西胺对持续性钠离子电流抑制的浓度依赖性和电压依赖性:分别测量出在钳制电压(Vh)为-70mV和-90mV时,伊来西胺的半数最大抑制浓度(IC50);并与其他抗癫痫药物(卡马西平与拉莫三嗪)的IC50值进行比较,了解伊来西胺的作用强度与作用的电压依赖性。测量治疗剂量下伊来西胺对VGSCs激活状态、失活状态及失活恢复状态等的影响,计算不同状态下的V1/2值、曲线斜率k、及时间常数τ,并用软件分析结果,将这些结果与卡马西平、拉莫三嗪等抗癫痫药物作用于锥体神经元放电的特征比较,找出伊来西胺与卡马西平、拉莫三嗪等药物对VGSCs影响的异同;进一步了解治疗浓度下伊来西胺对VGSCs的作用机制,确认伊来西胺在治疗浓度下作用的主要目标。5.统计学分析计量资料以均数±标准差( X±S)表示,统计方法用SPSSl6.0 for Windows软件包进行统计分析,采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义研究结果1. FVB品系WT鼠海马神经元上Nav1.1蛋白显著表达Nav1.1通道蛋白在海马区的神经元均有表达。2.钳制电位变化时不同浓度拉莫三嗪对钠电流的影响对全细胞记录状态下的WT鼠海马锥体神经元给予不同浓度的拉莫三嗪作用,记录给药前后钠电流的变化。计算得出钳制电位为-90mV时拉莫三嗪的IC50值为1200μM;钳制电位为-70mV时拉莫三嗪的IC50值为400μM。3.钳制电位变化时不同浓度伊来西胺对钠电流的影响对全细胞记录状态下的WT鼠海马锥体神经元给予不同浓度的伊来西胺作用,记录给药前后钠电流的变化。计算得出钳制电位为-90mV时伊来西胺的IC50值为5.2μM;钳制电位为-70mV时伊来西胺的IC50值为0.4μM。4. -90mV时10μM伊来西胺给药前后海马钠通道电生理特性比较4.1.钠通道的激活WT鼠锥体神经元正常状态下V1/2与k值分别为(n=5):-36.63±0.22(mV),3.87±0.19;WT鼠锥体神经元给药后V1/2与k值分别为(n=5):-43.93±0.90(mV),4.22±0.70。差异有统计学意义(P<0.05)。4.2.钠通道的失活WT鼠锥体神经元正常状态下V1/2与k值分别为(n=5):-43.76±0.49(mV),7.03±0.43;WT鼠锥体神经元给药后V1/2与k值分别为(n=5):-61.74±0.65(mV),8.19±0.58。差异有统计学意义(P<0.05)。4.3.钠通道的失活后恢复WT鼠锥体神经元正常状态下恢复时间常数τ值为(n=5):2.05±0.42(ms);WT鼠锥体神经元给药后恢复时间常数τ值为(n=5):2.20±0.16(ms)。差异无统计学意义(P>0.05)。4.4.钠通道激活与失活窗口变化WT鼠锥体神经元正常状态下与给药后激活曲线与失活曲线窗口下面积比值为(n=5)1:0.53。可见明显缩小。结论1.本研究首次通过全细胞膜片钳技术研究伊来西胺对神经元钠通道的影响,电生理研究发现伊来西胺对钠电流有显著抑制作用,不同钳制电位下伊来西胺对钠通道作用强度有显著性差异:计算得出钳制电位为-90mV时伊来西胺的IC50值为5.2μM;钳制电位为-70mV时伊来西胺的IC50值为0.4μM。与拉莫三嗪相比,对神经元钠通道起作用所需的伊来西胺浓度更低。和拉莫三嗪类似,伊来西胺对神经元上钠通道的作用有着电压依赖性及浓度依赖性。2.本研究首次发现伊来西胺对WT鼠锥体神经元上VGSCs的通道特性有影响:2.1.伊来西胺能使WT鼠锥体神经元上VGSCs的激活曲线往超极化方向移动(左移);2.2.伊来西胺能使WT鼠锥体神经元上VGSCs的失活曲线往超极化方向移动(左移);2.3.伊来西胺对WT鼠锥体神经元上VGSCs的失活恢复曲线没有影响;2.4.伊来西胺能使WT鼠锥体神经元上VGSCs的激活、失活曲线之间的窗口面积缩小;说明相比之下,伊来西胺更主要作用于VGSCs的失活通道。3.本研究认为伊来西胺可能与锥体神经元上VGSCs蛋白作用,延长了锥体神经元上VGSCs的失活状态,从而抑制了持续去极化(电压依赖性),使锥体神经元兴奋性降低,为伊来西胺的抗癫痫作用的分子机制提供了依据。但对于伊来西胺显示出的良好耐受性和轻微副作用的原因需要进一步药代动力学研究;伊来西胺与旧的抗癫痫药物药物相互作用以及伊来西胺对不同原因导致的癫痫治疗效果及其分子机制也是下一步研究的重点。