【研究背景】肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最为普遍肾实质肿瘤，其具有高致死率，并且发生率也持续升高。目前，临床治疗肾细胞癌主要采取手术治疗、免疫治疗以及疫苗治疗等方法，然而肾细胞癌病人的预后仍然较差；因此，新药物及其机制研发仍十分迫切。传统中药由于具有低毒，特异性等特征，在肿瘤的治疗方面备受关注。丹参酮ⅡA为传统中草药丹参（Salvia miltiorrhiza BUNGE）根部中提取物，传统药理公认其具有抗氧化以及抗衰老功效。近来研究表明：丹参酮ⅡA能够发挥抗肿瘤活性，成为研究热点。然而，关于丹参酮ⅡA是否对肾细胞癌有抗肿瘤作用效果其分子机制如何尚待明确。【研究目的】研究丹参酮ⅡA诱导肾细胞癌786-O细胞凋亡及其分子机制。具体来说，明确丹参酮ⅡA处理786-O细胞后，对786-O细胞生长活力的影响；探讨丹参酮ⅡA诱导786-O细胞周期阻滞和细胞凋亡的信号通路及其分子机制。【研究方法】首先，采用不同浓度的丹参酮ⅡA（0μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL）处理24h的肾细胞癌786-O细胞后，用MTT方法检测786-O细胞活力的影响。同时，采用不同浓度的丹参酮ⅡA（0μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL和40μg/mL）处理24h的正常肾细胞293A细胞后，同样应用MTT方法检测丹参酮ⅡA处理24h的293A细胞活力。随后，应用流式细胞技术（PI单染色）分析不同浓度丹参酮ⅡA处理前后786-O细胞周期分布变化，以明确丹参酮ⅡA对786-O细胞生长影响。再采用western blot检测细胞周期阻滞相关靶蛋白cyclin A的表达水平，来印证786-O细胞的周期阻滞。为进一步探讨周期阻滞的分子机制，用western blot检测p21和p53的表达水平。然后，用流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI双染色）检测丹参酮ⅡA处理786-O细胞后，细胞凋亡的情况。并用western blot检测p53下游靶基因（Fas和bax）和凋亡效应蛋白caspase-3表达水平。最后，采用western blot实验检测MDM2的表达，以确定MDM2是否影响了p53的上调。还通过构建GFP-NPM质粒，以GFP-NPM转染786-O细胞后，应用激光共聚焦显微镜观察GFP-NPM细胞定位情况；并且用免疫共沉淀技术验证53与NPM是否发生物理相互作用，来确定p53是否受NPM正向调控。【研究结果】（1） MTT实验表明丹参酮ⅡA处理24小时对786-O细胞的半数抑制浓度IC50约为2μg/mL；而丹参酮ⅡA处理24小时对人胚肾293A细胞的半数抑制浓度IC50约为8μg/mL。（2）应用浓度分别为0，2，4和8μg/mL的丹参酮ⅡA处理肾细胞癌786-O细胞24小时后，流式细胞术PI单染色法检测出细胞周期处于S期的细胞所占百分比分别为10.0%，11.5%，20.4%和23.3%。western blot表明细胞周期S期的标志性蛋白cyclin A表达呈药物浓度梯度提高。丹参酮ⅡA处理引起p21蛋白表达显著升高，并呈药物浓度依赖方式上调。p53蛋白表达显著升高，并且呈现药物浓度依赖关系。（3）流式细胞术AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡的结果表明，当用不同浓度丹参酮ⅡA（2，4和8μg/mL）处理肾细胞癌786-O细胞24小时后，早期凋亡细胞数量从8.6％（对照组）分别增加到27.2％，27.8％和28.8%；晚期凋亡细胞从对照组的2.9％分别增加到9.2％，12.5％和13.9%。凋亡细胞百分率则从对照组的11.5%分别增加到36.4％，40.3％和42.7%，作用效果与丹参酮ⅡA药物浓度呈正比。western blot显示丹参酮ⅡA处理Fas表达没有变化，且丹参酮ⅡA处理引起bax蛋白表达显著升高，呈现药物浓度依赖关系。还显示了caspase-3表达升高，表明caspase-3被激活。（4） western blot结果显示p53负性调节子MDM2表达水平没有变化。激光共聚焦显微镜观察到GFP-NPM从核仁移位到核浆中。免疫共沉淀实验表明NPM能和p53发生相互作用。【结论】（1）丹参酮ⅡA能够以浓度依赖方式显著抑制786-O细胞生长活力；丹参酮ⅡA对肾细胞癌786-O细胞有显著的抑制作用，但对正常的人胚肾293A细胞没有明显的细胞毒性作用。（2）丹参酮ⅡA可诱导肾细胞癌786-O细胞周期S期阻滞。其分子机制为：丹参酮ⅡA诱导肾细胞癌786-O细胞p53及其转录调控靶基因p21上调，且p53通过转录上调p21蛋白表达水平，参与介导丹参酮ⅡA诱导肾细胞癌786-O细胞周期S期阻滞。（3）丹参酮ⅡA可进一步诱导肾细胞癌786-O细胞凋亡。在此过程中，p53转录下游靶基因Fas没有变化，而bax上调，凋亡效应蛋白caspase-3上调，表明bax参与丹参酮ⅡA诱导的肾细胞癌786-O细胞凋亡，丹参酮ⅡA诱导的肾细胞癌786-O细胞凋亡是通过线粒体途径，而非循Fas通道。（4）丹参酮ⅡA处理肾细胞癌786-O细胞，可使其核仁蛋白NPM从核仁穿梭到核浆，且NPM和p53发生相互作用，表明NPM参与p53翻译后调控，维持了p53的稳定性，从而使p21蛋白表达水平上调。本研究不但证明了丹参酮ⅡA可有效地抑制肾细胞癌786-O细胞生长增殖，并诱导细胞发生周期阻滞以至凋亡，还通过分子实验数据揭示了丹参酮ⅡA处理肾细胞癌786-O细胞通过驱动NPM从细胞核仁穿梭到核浆，使与核浆定位的p53发生共定位，进而增强NPM和p53相互作用，促进p53稳定性，继而转录激活其下游靶基因p21和bax蛋白水平上调的抑癌作用机制。并通过对正常人胚肾293A细胞的作用研究，证明丹参酮ⅡA可在基本不影响正常细胞情况下起肿瘤抑制作用，对有关肿瘤治疗的研究可起重要指导作用。