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第一部分大鼠局灶性预缺血诱导脑缺血耐受模型的建立
目的:
建立大鼠局灶性脑缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)诱导脑缺血耐受模型,探讨该模型的应用价值。
方法:
将88只健康雄性Wistat大鼠随机分成3组:假手术组(n=8),未缺血预处理组(non-ischemic preconditioning,NIP；n=40),缺血预处理组(IP,n=40),后两组再随机分成5个业组。线栓法阻塞大脑中动脉(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)完成局灶性缺血预处理,缺血预处理10 min后,分别在缺血预处理后1,3,7,14,21d进行再次缺血2h再灌注22h然后取脑检查。未缺血预处理组用假手术代替预缺血,在假手术后按前述不同时间点给予2h缺血处理,再灌注22h后处死。假手术组两次均为假手术。模型建立后,通过对大鼠进行神经功能评分、测定其脑梗死体积及细胞凋亡对该模型进行评估。
结果:
(1)组间比较:与NIP组相比,IP组中的1,3,7d业组神经功能评分及脑梗死体秋明显降低(P<0.05或P<0.01)；IP组中的1,3,7,14d业组凋亡细胞计数明显减少(P<0.05)。
(2)组内比较:IP组各业组间神经功能评分差异无统计学意义；IP组1,3,7d亚组梗死体积较14,21d亚组减小,其中以3d业组梗死体积减小最为明显(P<0.05)；IP组以3,7d亚组平均凋亡细胞计数较其他业组明显减少(P<0.05)。
结论:
本研究结果表明10 min缺血预处理对大鼠致死性脑缺血产生明显的保护作用,即诱导产生脑缺血耐受,线栓法制备脑缺血耐受模型切实可行。
第二部分缺氧诱导因子-1α和促红细胞生成素蛋白及mRNA与脑缺血耐受的关系
目的:
动态检测预处理后缺血再灌注不同时间窗缺氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)蛋白及mRNA的表达,探讨其在脑缺血耐受形成中的作用。
方法:
将健康雄性Wistar大鼠99只随机分3组:假手术组(n=9),未缺血预处理组(non-ischemic preconditioning,NIP；n=45),缺血预处理组(IP,n=45),后两组再随机分成5个业组。对IP组大鼠,线栓法阻塞大脑中动脉(middle cerebralartery occlusion,MCAO)建立局灶性缺血预处理模型,缺血预处理10 min后,分别在缺血预处理后1,3,7,14,21d进行再次缺血2h,再灌注22h然后取脑检查。NIP组用假手术代替预缺血,在假手术后按前述不同时间点给予2h缺血处理,再灌注22h后处死。假手术组两次均为假手术。应用免疫组化方法检测缺血侧半球大脑皮质区、纹状体及海马区HIF-1α与EPO蛋白的表达,逆转录聚合酶链式反应技术检测缺血侧半球额顶部上部皮质HIF-1α和EPO mRNA的表达。
结果:
(1)组间比较:与NIP组相比,IP组1,3,7d业组缺血侧半球大脑皮质区、纹状体及海马区HIF-1α蛋白表达明显增高(P<0.05或P<0.01),IP组3,7d亚组缺血侧半球大脑皮质区、纹状体及海马区EPO蛋白表达明显增高(P<0.05)；IP组3,7d业组半球额顶部上部皮质HIF-1α及EPO mRNA表达明显增高(P<0.05)。
(2)组内比较:IP组3,7d亚组缺血侧半球大脑皮质区、纹状体及海马区HIF-1α、EPO蛋白表达以及半球额顶部上部皮质HIF-1α和EPO mRNA表达均明显高于1,14,21d业组(P<0.05)。
(3)EPO mRNA表达与HIF-1αmRNA表达呈显著正相关(P<0.01)。
结论:
缺血预处理诱导了脑缺血耐受,预缺血诱导的内源性HIF-1α及其靶基因EPO表达增加参与脑缺血耐受形成的机制。
第三部分脑缺血耐受大鼠血脑屏障通透性改变及MMP-9的表达
目的:
检测脑缺血预处理诱导脑缺血耐受大鼠再灌注不同时间窗血脑屏障(blood—brain barrier,BBB)通透性及基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)表达的变化,并探讨其在脑缺血耐受形成中的作用。
方法:
将110只健康雄性Wistar大鼠随机分成3组:假手术组(n=10),未缺血预处理组(non-ischemic preconditioning,NIP；n=50),缺血预处理组(IP,n=50),后两组再随机分成5个业组。线栓法阻塞大脑中动脉(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)完成局灶性缺血预处理,缺血预处理10 min后,分别在缺血预处理后1,3,7,14,21d进行再次缺血2h再灌注22h然后取脑检查。未缺血预处理组用假手术代替预缺血,在假手术后按前述不同时间点给予2h缺血处理,再灌注22h后处死。假手术组两次均为假手术。采用HE染色观察病理变化并测定脑梗死体积,测定伊文思蓝(EB)的渗出量以评价血脑屏障通透性的变化,分别采用免疫组化法和原位杂交法检测MMP-9蛋白及mRNA的表达。
结果:
(1)组间比较:与NIP组相比,IP组的1,3,7d业组神经功能评分、梗死体积、EB含量、脑含水量以及MMP-9蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。两组之间比较,14,21d业组各项指标的表达均无明显差异。
(2)组内比较:IP组1,3,7d业组梗死体积和MMP-9 mRNA表达明显,IP组3,7d业组EB含量、脑含水量以及MMP-9蛋白表达明显降低,其中以3d亚组降低最为明显。NIP组中各亚组之间比较,神经功能评分、梗死体积、EB含量、脑含水量以及MMP-9蛋白和mRNA表达均无显著性差异。
结论:
缺血预处理诱导了脑缺血耐受,预缺血诱导的血脑屏障通透性改变以及MMP-9表达减低在脑缺血耐受中发挥重要作用。
第四部分脑缺血耐受大鼠VEGF和Ang-1表达与血管形成的实验研究
目的:
探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)在短暂性脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用及与血管形成的关系。
方法:
将55只健康雄性Wistar大鼠随机分成3组:假手术组(n=5),未缺血预处理组(non-ischemic preconditioning,NIP；n=25),缺血预处理组(IP,n=25),后两组再随机分成5个亚组。线栓法阻塞大脑中动脉(middle cerebral arteryocclusion,MCAO)完成局灶性缺血预处理,缺血预处理10 min后,分别在缺血预处理后1,3,7,14,21d进行再次缺血2h再灌注22h然后取脑检查。未缺血预处理组用假手术代替预缺血,在假手术后按前述不同时间点给予2h缺血处理,再灌注22h后处死。假手术组两次均为假手术。动态观察VEGF、Ang-1及其受体Tie-2蛋白和mRNA及脑微血管密度(MVD)的变化。采用免疫组化法检测VEGF、Ang-1、Tie-2及CD34蛋白的表达,原位杂交法检测VEGF、Ang—1及Tie-2 mRNA的表达。
结果:(1)组间比较:与NIP组相比,1,3,7d业组VEGF、Tie-2蛋白和mRNA表达明显增高；7d亚组Ang-1蛋白表达明显增高；3,7d亚组MVD表达以及Ang-1mRNA表达明显增高。两组之间比较,14,21d亚组VEGF、Ang-1、Tie-2及CD34等各项指标的表达均无明显差异。
(2)组内比较:IP组7d亚组微血管在缺血灶周边区分布最为密集,MVD明显高于同组内其它亚组；3,7d亚组VEGF、Tie-2蛋白和mRNA表达明显增高,Ang-1蛋白和mRNA在IP后3d表达开始升高,高峰出现在IP后7d。VEGF、Ang-1、Tie-2及CD34等各项指标在NIP组各亚组之间无显著性差异。
结论:
VEGF和Ang-1在缺血预处理产生脑缺血耐受的相应时间窗内表达有所增加,血管形成可能在脑缺血耐受中发挥了重要作用。