论文部分内容阅读
地黄(Rehmannia glutinosa )是玄参科地黄属药用草本植物，因其块根中包含丰富的生物活性化合物，具有抗心血管疾病、保护神经、抗高血压、增强免疫力等诸多药用价值和经济价值，因此备受人们青睐，广为研究。毛蕊花糖苷作为地黄的指标组分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、创伤愈合、神经保护等人体健康药理活性。然而，只有这些发现的化合物是不够的，因为地黄还具有很多非常复杂的化合物，需要新技术进行探索。本研究以地黄块根为材料，采用非靶向LC-MS代谢组学的方法，结合多变量分析比较，对三个发展阶段的地黄伸长根(ER)，膨大根(TR)和成熟根(MR)进行了新型代谢概况分析，来鉴别目前存在的差异代谢产物和酶，揭示差异代谢产物的变化模式如何促进块根的发育；更加详细地探究代谢物的代谢网络，揭示地黄块根的形成和发育过程；进一步完善毛蕊花糖苷的生物合成途径；对挖掘出的根不同发育时期的差异酶基因进行了qRT-PCR检验；用重组技术构建了关键酶P-香豆酸3-羟化酶RgC3H1的植物过表达载体并进行转化。主要结果如下：
1、利用非靶向LC-MS代谢组学分析地黄不同发育阶段的块根进行中的代谢物，预先获得了3686个代谢物的质荷比，构成了地黄代谢物数据矩阵，通过m/z数据、HMDB数据库和METLIN数据库对得到1049个代谢物进行初步分析。在三个比较组ER/TR，TR/MR和ER/MR中一共发现了562种差异代谢物，任意两个比较组之间有434个非重复性差异代谢物，其中281个代谢物是三个根比较组中常见的差异代谢物。从数据上看，在本研究中构建了一个含有丰富代谢物信息的地黄代谢组学数据库。
2、将434个差异代谢物映射到包括62种酶的111KEGG途径，从这些KEGG途径中，筛选出与毛蕊花糖苷合成的相关的五个候选途径，包括酪氨酸代谢途径，苯丙氨酸代谢途径，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径，苯丙烷生物合成途径和基于推定途径的异喹啉生物碱生物合成途径，挖掘和验证了相关酶基因P-香豆酸3-羟化酶RgC3H1和酪氨酸氨基转移酶RgTAT，筛选出了我们假设的中间产物(4-O-咖啡酰-β-D-葡萄糖、脱咖啡酸配体毛蕊花糖苷和脱鼠李糖配体毛蕊花糖苷),进一步完善了毛蕊花糖苷生物合成途径。
3、预先鉴定的434个差异代谢物分布结果表明，地黄根的所有发育阶段都具有一些药用和营养价值的代谢物。其中，ER/MR中有变化的代谢物为149个，ER/TR为200个，TR/MR为85个，总共为434.相应的差异代谢物增加百分比ER/TR，TR/MR和ER/MR比较组分别为55.0％，33.0％和44.3％。根的药用和营养价值取决于其发育阶段：根发育的时间越长，其潜在的药用和营养价值越大。因此，MR(成熟根)可能提供最多的药用和营养成分。
4、通过代谢网络分析，发现前10个KEGG途径中代谢产物之间的相互作用和数量不尽相同，而且3个比较组之间酶的表达水平和数量也不同。差异代谢物的升高和降低水平与前十种途径和酶的增加和降低相关。TR/MR中的9种代谢物和8种酶、ER/TR中的31种代谢物和38种酶以及ER/MR中的33种代谢物和33种酶，代谢物和酶的总数如下排列：ER/TR>ER/MR>TR/MR，这为评估地黄根的质量和确定其收获时间提供了关键信息，揭示了地黄根的发育是一个复杂的过程，涉及许多途径、酶和差异代谢物。
5、为了验证代谢组技术挖掘的三个时期差异表达酶基因，采用qRT-PCR技术检测其在地黄金九块根的不同发育时期的表达量的差异，选取MR/TR时期的1个上调基因和2个下调基因，TR/ER时期的12个上调基因和5个下调基因，ER/MR时期的12个上调基因和3个下调基因，对代谢组挖掘的酶基因表达差异进行定量验证，发现两者的结果一致。
6、根据代谢组数据成功克隆出地黄毛蕊花糖苷生物合成途径关键酶基因P-香豆酸3-羟化酶RgC3H1的CDS区，对其进行了生物信息学分析，并构建了植物表达载体pCAMBIA1300-RgC3H1并转化GV3101根癌农杆菌，进行过表达研究和基因功能验证。通过筛选合适的潮霉素选择压和筛选培养基，采用圆叶片浸染法，进行了转地黄植株抗性愈伤、芽和再生植株的诱导；对野生型拟南芥种子进行春化后发芽培养，采用花序浸染法进行转基因拟南芥植株的筛选。
总之，我们的研究结果扩大了地黄代谢物数据库，揭示了代谢物、酶和代谢途径互作网络调控地黄根发育以及质量控制，进一步完善了其毛蕊花糖苷的生物合成途径，为地黄化学成分析、根发育机理的阐明、质量控制指标的研究和分子育种提供依据。
1、利用非靶向LC-MS代谢组学分析地黄不同发育阶段的块根进行中的代谢物，预先获得了3686个代谢物的质荷比，构成了地黄代谢物数据矩阵，通过m/z数据、HMDB数据库和METLIN数据库对得到1049个代谢物进行初步分析。在三个比较组ER/TR，TR/MR和ER/MR中一共发现了562种差异代谢物，任意两个比较组之间有434个非重复性差异代谢物，其中281个代谢物是三个根比较组中常见的差异代谢物。从数据上看，在本研究中构建了一个含有丰富代谢物信息的地黄代谢组学数据库。
2、将434个差异代谢物映射到包括62种酶的111KEGG途径，从这些KEGG途径中，筛选出与毛蕊花糖苷合成的相关的五个候选途径，包括酪氨酸代谢途径，苯丙氨酸代谢途径，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径，苯丙烷生物合成途径和基于推定途径的异喹啉生物碱生物合成途径，挖掘和验证了相关酶基因P-香豆酸3-羟化酶RgC3H1和酪氨酸氨基转移酶RgTAT，筛选出了我们假设的中间产物(4-O-咖啡酰-β-D-葡萄糖、脱咖啡酸配体毛蕊花糖苷和脱鼠李糖配体毛蕊花糖苷),进一步完善了毛蕊花糖苷生物合成途径。
3、预先鉴定的434个差异代谢物分布结果表明，地黄根的所有发育阶段都具有一些药用和营养价值的代谢物。其中，ER/MR中有变化的代谢物为149个，ER/TR为200个，TR/MR为85个，总共为434.相应的差异代谢物增加百分比ER/TR，TR/MR和ER/MR比较组分别为55.0％，33.0％和44.3％。根的药用和营养价值取决于其发育阶段：根发育的时间越长，其潜在的药用和营养价值越大。因此，MR(成熟根)可能提供最多的药用和营养成分。
4、通过代谢网络分析，发现前10个KEGG途径中代谢产物之间的相互作用和数量不尽相同，而且3个比较组之间酶的表达水平和数量也不同。差异代谢物的升高和降低水平与前十种途径和酶的增加和降低相关。TR/MR中的9种代谢物和8种酶、ER/TR中的31种代谢物和38种酶以及ER/MR中的33种代谢物和33种酶，代谢物和酶的总数如下排列：ER/TR>ER/MR>TR/MR，这为评估地黄根的质量和确定其收获时间提供了关键信息，揭示了地黄根的发育是一个复杂的过程，涉及许多途径、酶和差异代谢物。
5、为了验证代谢组技术挖掘的三个时期差异表达酶基因，采用qRT-PCR技术检测其在地黄金九块根的不同发育时期的表达量的差异，选取MR/TR时期的1个上调基因和2个下调基因，TR/ER时期的12个上调基因和5个下调基因，ER/MR时期的12个上调基因和3个下调基因，对代谢组挖掘的酶基因表达差异进行定量验证，发现两者的结果一致。
6、根据代谢组数据成功克隆出地黄毛蕊花糖苷生物合成途径关键酶基因P-香豆酸3-羟化酶RgC3H1的CDS区，对其进行了生物信息学分析，并构建了植物表达载体pCAMBIA1300-RgC3H1并转化GV3101根癌农杆菌，进行过表达研究和基因功能验证。通过筛选合适的潮霉素选择压和筛选培养基，采用圆叶片浸染法，进行了转地黄植株抗性愈伤、芽和再生植株的诱导；对野生型拟南芥种子进行春化后发芽培养，采用花序浸染法进行转基因拟南芥植株的筛选。
总之，我们的研究结果扩大了地黄代谢物数据库，揭示了代谢物、酶和代谢途径互作网络调控地黄根发育以及质量控制，进一步完善了其毛蕊花糖苷的生物合成途径，为地黄化学成分析、根发育机理的阐明、质量控制指标的研究和分子育种提供依据。