肠道是哺乳动物最大的营养吸收器官,在生命过程中发挥着重要作用。小肠上皮由隐窝和绒毛两部分组成,负责消化食物、吸收营养和抵御病菌入侵。肠道成体干细胞维持了肠道快速更新,每3-5天更新一次并产生新的细胞替代绒毛顶端凋亡、脱落的上皮细胞。肠道干细胞在肠道损伤修复中是十分重要的,肠道干细胞位于隐窝底部,包括增殖活跃且对射线敏感的干细胞群(Lgr5+)和增殖缓慢、对射线不敏感的静息干细胞群(Bmil+)。射线照射后,Lgr5+)干细胞绝大部分消融,Bmil+静息干细胞和部分祖细胞主要负责肠道损伤修复。中低剂量的X射线全身性照射小鼠能引起细胞DNA损伤并快速修复,是研究损伤修复的理想模型。本论文就是利用X射线全身性辐射小鼠以及肠道细胞构建损伤修复模型。CRL复合物是目前已知的最大的E3泛素连接酶复合物,在蛋白泛素化以及泛素介导的蛋白质降解中有着至关重要的作用。CUL4B通过与DDB1和ROC1结合形成 CULLIN 4B-RING 泛素连接酶复合物(Cullin 4B-RING Ubiquitin E3 Ligase,CRL4B)。本实验室前期研究发现CUL4B参与调控包括细胞周期、信号转导、DNA损伤修复等在内的多种生理过程。实验室前期未发表数据表明CUL4B可以通过WNT信号通路促进肠道干细胞的自我更新。肠道干细胞在维持肠道的自我更新和损伤修复中有重要功能,然而CUL4B在肠道损伤修复中的作用并不明确。因此,本论文工作主要就CUL4B在肠道损伤修复中的作用及其机制进行探讨,主要包括以下三个方面:1.利用大鼠隐窝细胞IEC-6分析敲低Cul4b基因对射线损伤修复的影响:首先我们利用IEC-6细胞系构建研究CUL4B作用的体外模型,采用3Gy的X射线照射Cul4b低表达IEC-6细胞与对照正常细胞,在照射后12h、24h、36h、48h收取细胞进行分析。发现:1)射线照射增加对照细胞CUL4B表达水平,提示CUL4B在损伤修复中发挥作用;2)对不同时间点细胞的增殖分析显示Cul4b敲低的细胞增殖变慢;3)细胞凋亡分析显示敲低Cul4b射线照射引起的细胞凋亡减少;4)细胞中γ-H2AX检测发现,在未照射时,γ-H2AX在Cul4b敲低的细胞高于对照细胞,提示敲低Cul4b导致DNA损伤;但在照射后不同时间点检测发现,在敲除Cul4b细胞中γ-H2AX的表达水平明显低于对照细胞,这提示敲低Cul4b导致DNA损伤应答异常。以上结果说明CUL4B参与DNA损伤应答。2.特异性敲除肠上皮细胞Cul4b基因对射线损伤修复的影响:为了验证以上体外实验观察到的结果,我们首先利用实验室前期构建的Cul4bfn/fn小鼠与pVillin-Cre+/-小鼠交配获得了肠上皮细胞特异性敲除Cul4b小鼠pVillin-Cre+/-;Cul4bfn/Y(KO)。采用12Gy的X射线照射KO和WT型小鼠,在照射后第1、3、5、7天收取小肠进行分析。结果显示:1)射线照射显著上调小肠组织CUL4B表达水平;2)组织学分析显示Cul4b敲除小鼠隐窝-绒毛结构较对照组小;3)增殖分析显示敲除型小鼠的增殖变慢;4)细胞凋亡分析显示敲除Cul4b射线照射引起的细胞凋亡更少;5)γ-H2AX蛋白表达分析显示,未照射时KO小鼠明显高于对照小鼠WT,而在照射后敲除小鼠却低于对照小鼠,与体外观察结果一致,说明Cul4b缺失导致肠道DNA损伤应答缺陷。3.CUL4B影响肠道射线损伤修复机制的初步探讨:为了进一步探究CUL4B调控肠道损伤修复的可能机制,我们对Cul4b敲除及对照小鼠肠道射线照射后的第0、3、7天进行mRNA测序,检测射线照射后不同时间点的差异表达基因并进行生物信息学分析,发现p53通路改变。用Western Blot分析小鼠肠道中p53蛋白的表达情况,发现在未照射时,p53在敲除型小鼠中表达量更高,而在射线照射后第1、第3天时野生型小鼠p53的表达量明显升高,而敲除小鼠无显著升高,提示射线照射后CUL4B激活p53信号通路且敲除小鼠损伤应答异常。对p53信号通路下游的凋亡基因Puma和Bax基因进行检测,发现类似于p53表达趋势,在Cul4b敲除后显著下调,提示CUL4B可能抑制损伤过程中p53信号通路调控的细胞凋亡。同时我们对p-BRCA1蛋白进行检测发现,敲低Cul4b导致磷酸化BRCA1水平增加,进一步说明敲低Cul4b导致损伤应答异常。本研究中,我们利用射线辐射肠道的经典模型,并选择肠道上皮特异性敲除Cul4b基因小鼠和大鼠隐窝上皮Cul4b基因低表达的IEC-6细胞系,都是肠道损伤修复研究的理想模型,研究了 CUL4B在肠道损伤修复中的作用,该论文的结论为放射性肠炎以及肠道损伤修复理论和临床治疗提供了依据。但是未构建Cul4b高表达的模型,后续研究将进一步开展体内和体外实验完善CUL4B在肠道损伤修复中的作用。