在生命科学研究蓬勃发展的今天,实验动物在科学研究中的作用日益突出。小鼠是应用最为广泛的实验动物之一,C57BL/6J品系小鼠作为一种近交小鼠,因其遗传背景稳定,成为生殖生物学、肿瘤学、生理学、免疫学和遗传学研究中常用的品系,大多数转基因小鼠均以C57BL/6J小鼠为遗传背景制作出来。如何对这些基因工程小鼠进行科学保种,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。目前,利用体外受精技术结合胚胎冷冻保存对小鼠进行资源保存已经得到长足的发展,而卵母细胞体外成熟属于体外胚胎生产的基础环节,卵巢异体原位移植也是保存雌性小鼠生殖功能并获得自然妊娠子代的有效手段,两者都是小鼠资源保种工作中必不可缺的基础环节；在研究不孕症治疗模型方面也有着广阔的应用前景。因此,研究小鼠卵母细胞体外成熟及卵巢移植具有重要的实际意义。本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象,旨在通过对该品系小鼠卵母细胞体外成熟体系的研究提高体外成熟卵子受精后的卵裂率及胚胎的继续发育能力,通过卵巢异体原位移植得到自然妊娠,产生供体卵巢后代,为小鼠种质资源保存奠定基础,为相关的实验研究提供参考。1.小鼠卵母细胞体外成熟研究本试验以C57BL/6J小鼠为研究对象,研究小鼠卵母细胞体外成熟与体外受精的多种影响因素,包括PMSG处理、小鼠周龄、培养液、卵巢组织液(mOTF)添加、培养时间、卵丘细胞、激光破膜和精子获能时间等,旨在建立适当方法以获得试管小鼠。以小鼠卵母细胞体外培养成熟、体外受精后的卵裂率来评价成熟效果。结果表明：(1)PMSG处理对小鼠卵母细胞体外成熟具有促进作用,处理组的卵裂率显著高于对照组(73.10%对68.73%,P<0.05)；(2)4-9周龄小鼠分离到的未成熟卵母细胞不仅数量多,而且无论卵丘-卵母细胞复合体(COC)还是裸卵(DO)其卵子成熟后比其他组具有更高的卵裂率,虽然1年龄小鼠卵裂率与4-9周龄无差异,但其卵巢上分离得到的卵子数量显著少于4-9周龄(14枚／只对116枚／只)；(3)3种培养液添加胎牛血清(FBS)后,M16培养液比DMEM和MEM-α更适合小鼠卵母细胞的体外成熟,3组卵裂率分别为51.56%、45.58%和38.10%；(4)在M16+FBS基础上添加小鼠卵巢组织液(mOTF)能显著提高卵子成熟效果,添加或不添加mOTF所获卵裂率分别为80.07%和51.56%,两组间差异显著(P<0.05)；(5)卵母细胞体外成熟培养时间以18h为最佳；(6)COC比起DO有更好的成熟效果和较高的卵裂率,卵裂率分别为79.82%和53.86%,两组有显著差异(P<0.05)；(7)体外成熟的裸卵,在体外受精前,挑选有pbI的卵子进行激光破膜后的卵裂率都明显较不处理组为高(69.91%对58.75%；P<0.05)；(8)精子获能4h,可提高卵子体外受精卵裂率,显著高于传统上2h获能的卵裂率(83.87%对49.51%；P<0.05)。本试验结果表明,选择4周龄C57BL/6J小鼠,腹腔注射10IU/只PMSG处理48h后,分离卵母细胞以M16+10%FBS+10%mOTF培养18h,并以获能4h的精子进行体外受精,为小鼠卵母细胞最佳体外成熟方案,所获卵裂率与体内成熟卵母细胞对照组卵裂率无显著差异(85.14%对90.19%；P>0.05)。将获得的2-细胞进行胚胎体外培养获得囊胚发育,进行胚胎移植后成功获得2只试管小鼠。2.卵巢异体原位移植研究本研究以3个转基因品系小鼠及其背景鼠作为研究对象,转基因小鼠Ptet-mPTA1与LAP/rtTA的背景鼠为近交系小鼠C57BL/6J,HBV-x小鼠的背景鼠为封闭群小鼠ICR/JCL。试验以此3个品系的转基因小鼠作为卵巢供体,异体原位移植到其背景鼠的卵巢包膜内,移植前切除1/2-2/3受体卵巢,饲养2个月后与背景鼠的雄鼠合笼,自然怀孕生产出子代,采集子代中尾尖提取基因组,结合PCR、电泳检测目的基因。出现阳性条带者判定为来源于供体卵巢,阴性判定为来源于受体卵巢。结果表明：(1)4只10日龄Ptet-mPTAl小鼠作为供体,卵巢移植给4只背景鼠,4只均成活、怀孕并产仔；基因检测表明,有阳性子代出现；4只10日龄LAP/rtTA小鼠作为供体,卵巢移植给4只背景鼠,4只均成活、怀孕并产仔,经基因检测证明有阳性子代出现；10日龄和4周龄HBV-x品系小鼠分别移植4只和17只,均成活,其中19只怀孕并产仔,经基因检定,无阳性结果出现；(2)对无阳性后代出现的受体解剖发现,卵巢移植体未得到生长,有的甚至坏死,有的与周围组织粘连、无血供或移植体丢失；(3)对有阳性结果出现的受体小鼠,进行解剖发现,移植体在卵巢包膜内有生长、有血供,显微镜下分离移植体,能观察到有卵泡生长,能够分离到未成熟的卵母细胞,包括COC和DO,按卵母细胞体外成熟的方法对分离到的卵母细胞进行体外成熟培养并作体外受精,能够得到形态正常的2-细胞胚胎,两组卵裂率分别为59.57%和52.08%。