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乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种重要的铁离子结合蛋白,属于糖蛋白家族成员,具有抗菌和杀菌、抗病毒以及调节机体免疫等多种功能,因此近年来乳铁蛋白被广泛应用于医学和食品领域,尤其是在婴幼儿配方奶粉中添加牛乳铁蛋白(Bovine lactoferrin,BLF)是当今研究的一个热点问题。目前乳铁蛋白的检测方法主要有高效液相色谱法、电泳法和酶联免疫吸附法,因酶联免疫吸附法具有快速方便,一次性可以同时检测多个样品的优点,因此在检测方法中具有更大的优势。本实验利用常规的细胞融合技术制备出了6株抗牛乳铁蛋白的单克隆抗体细胞株,分别为3H3、3A5、2B11、2B12、2E2和3D7,并将制备的腹水采用辛酸-硫酸铵法进行了纯化。采用间接ELISA方法对抗体进行了效价测定和抗体交叉测定,实验结果显示5株单克隆抗体的效价均在1:106以上;与牛乳中其它主要蛋白质酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白基本上无交叉反应;抗体亲和力实验结果显示2B12抗体的亲和常数最高,因此实验选择2B12抗体用于双抗体夹心实验。实验用牛乳铁蛋白抗原免疫新西兰大白兔获得了55 mL的兔多抗血清,并对其进行了饱和硫酸铵纯化,经测定多克隆抗体效价可达到1:107以上,与乳中主要蛋白质酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白交叉反应微弱。实验按照双抗体夹心ELISA步骤进行测定,以纯化的抗牛乳铁蛋白多克隆抗体包被酶标板,包被浓度为0.5μg/mL,以1%OVA37℃封闭1 h,以0.01 MPBS作为标准品稀释液,一抗稀释浓度为1:5000,建立了牛乳铁蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,绘制标准曲线方程为y=-0.2526x+1.7881,最低检测限为4.69 ng/mL,最适检测范围为4.69-200 ng/mL,本研究为研制婴幼儿配方奶粉中牛乳铁蛋白含量的检测试剂盒奠定了基础。