研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）因其高发病率及不良的预后而被人们所熟知。在全球,每年有近90万人死于结直肠癌,其病死率仅次于肺癌,乳腺癌和前列腺癌,位列第四名。在我国,结直肠癌的发病率和病死率在肿瘤人群中均位列前五名。多种分子信号通路的失调,可导致结直肠癌的发生并全力推动了结直肠癌的发展,这其中就包括癌基因同抑癌基因的功能失衡。泛素蛋白酶体系统是调节肿瘤信号通路的关键翻译后修饰之一。泛素化修饰是蛋白翻译后修饰中的一种,在许多细胞重要的生命活动中都需要泛素化修饰的参与并在其中发挥着不可替代的作用。泛素可以被泛素化活化酶E1激活,经过泛素化结合酶E2的传导作用,最后被泛素化连接酶E3识别并完成与特异性的蛋白质底物的共价结合。泛素连接酶E3可以招募底物并促进或直接催化泛素转移到目标物。泛素连接酶E3在很大程度上决定了泛素化反应的特异性。泛素连接酶E3的基因改变、表达异常或功能障碍可以导致人类癌症的发生和进展。事实上,相关抑癌分子的过度降解和致癌蛋白的降解障碍与肿瘤发生密切相关。结直肠癌的发病机制复杂、多样,涉及体细胞突变、基因异常融合、缺失或扩增以及表观遗传改变,可能导致结直肠癌中泛素化连接酶E3的异常表达或功能改变。大量研究表明,泛素化连接酶E3的功能缺陷参与了结直肠癌的分子病因和发病机制。异常表达的泛素化连接酶E3在结直肠癌中究竟起着促癌还是抑癌作用,这取决于泛素化的底物蛋白在结直肠癌中的作用。近年来,人们对于泛素化连接酶E3介导的泛素化修饰在结直肠癌发生和进展中的潜在作用方面的认识不断深入。TP53被认为是影响结直肠癌发生和发展的关键基因,TP53是结直肠癌中最常突变的基因之一。约40%-50%的结直肠癌存在TP53突变从而导致p53功能失活。p53作为转录因子也是抑癌蛋白,可以转录激活百余种的下游靶基因,促进靶基因表达。p53诱导表达的靶蛋白可以直接参与DNA的损伤修复过程,也可通过对细胞周期阻滞作用,为DNA损伤修复创造时机。事实上,p53主要是依靠其下游的靶蛋白p21来调控G1/S和G2/M细胞周期阻滞。虽然对于p53蛋白的调控可以发生于转录、翻译和蛋白修饰等多个阶段,但是p53的翻译后修饰对p53的调控作用最为重要,而p53的泛素化修饰是最重要也是研究最广泛的翻译后修饰。泛素化修饰可以抑制p53的功能活性并促进p53的核输出并介导其在细胞质中经蛋白酶体途径降解。多种泛素化连接酶E3可特异性识别p53,并将其作为泛素化底物。这其中最重要的泛素化连接酶E3是MDM2。除MDM2外,其他泛素E3连接酶如COP1、Pirh2和ARF-BP1被发现在特定环境下调控p53的泛素化和降解。RNF126（RING finger protein 126）作为一种新型的E3泛素连接酶,在一些实体肿瘤中起着致癌作用,但其在结直肠癌中的潜在作用却鲜有报道。因此,我们在本研究中探究了RNF126在结直肠癌的发展中的潜在作用及分子机制。第一部分:RNF126与p53在结直肠癌组织中的表达差异及与临床病理参数的相关性目的:观察RNF126在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达情况。探究RNF126和p53在结直肠癌组织中的表达相关性。分析RNF126的高表达与结直肠癌患者的临床病理参数的关系。分析RNF126的高表达与结直肠癌患者的术后生存时间之间的关系。研究方法:首先利用免疫组化技术检测RNF126在147例结直肠癌及癌旁组织中的表达情况。同时检测p53在147例结直肠癌组织中的表达情况。通过相关性分析（seaprman test）探究RNF126和p53在结直肠癌组织中的表达相关性。随后通过免疫印迹法检测RNF126在24例结直肠癌及癌旁组织中的蛋白表达情况。通过实时定量PCR技术检测RNF126在24例结直肠癌及癌旁组织中的m RNA表达情况。最后,通过卡方检验,探究RNF126高表达与结直肠癌患者的临床病理参数的相关性。通过Kaplan-meier单因素分析,探究RNF126和p53的高表达对结直肠患者术后生存时间的影响。结果:免疫组化结果提示与癌旁组织相比,RNF126在结直肠癌组织中高表达（54.4%,80/147 VS 30.6%,45/147,P<0.01）。在结直肠癌标本中,突变型p53的高表达率为51%（75/147）。经相关性分析（seaprman test）提示在结直肠癌组织中RNF126高表达与p53的高表达没有相关性（r=0.114,p=0.166）。免疫印迹法和实时定量PCR提示RNF126在结直肠癌组织中的蛋白和m RNA表达均明显高于癌旁组织中的表达。对于结直肠患者的临床病理参数的分析（卡方检验）提示RNF126的高表达与CRC患者肿瘤大小（P=0.021）,T分期（P=0.030）,淋巴结转移（P=0.006）和TNM分期（P=0.001）呈正相关。RNF126表达在147例结直肠癌患者的Kaplan-meier单因素分析提示RNF126高表达的结直肠癌患者术后生存时间更短,差异具有统计学意义（p=0.003）。结论:1、RNF126在结直肠癌组织中的蛋白和m RNA表达均明显高于癌旁组织中的表达。2、RNF126的高表达与结直肠癌患者的肿瘤的大小,局部浸润深度,淋巴结转移以及TNM分期等多个临床病理参数呈显著正相关。3、RNF126的高表达与结直肠癌病人的不良预后密切相关。4、RNF126和突变型p53在结直肠癌组织中的表达无相关性。第二部分:RNF126、p53和p21在结直肠癌细胞中的表达相关性及分子机制目的:探究RNF126和p53-p21在CRC细胞中的表达相关性及分子机制研究方法:利用细胞瞬时转染技术,构建RNF126的过表达和沉默细胞系。通过免疫印迹法和免疫共沉淀技术检测RNF126和p53-p21的相互作用,联合蛋白酶体抑制剂MG132,探讨RNF126是否介导p53的泛素化调控。结果:通过免疫印迹法验证RNF126过表达和沉默的瞬转细胞系构建成功。免疫印迹实验提示在表达突变型p53的colo-205和SW620结直肠癌细胞系中,RNF126沉默并不能改变突变型p53及p21的表达水平。但在表达野生型p53的结直肠癌细胞HCT116和HCT-8中,沉默RNF126可以上调p53和p21的表达,但抑制了p Rb的表达。这一过程可以通过p53的共沉默所逆转。反之,RNF126过表达可以下调p53和p21的表达,但上调了p Rb的表达,这一过程可通过经典的蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。通过实时定量PCR检测可发现,在RNF126沉默或过表达的细胞中,上述靶基因的m RNA水平没有变化,提示RNF126对p53-p21的调控发生在转录后水平。免疫共沉淀实验提示无论是以p53为沉淀蛋白还是以RNF126作为沉淀蛋白,RNF126和p53,p21均能形成共沉淀。进一步以p53为沉淀,检测p53的泛素化水平,沉默RNF126明显减弱p53的泛素化蛋白水平,提示p53的泛素化降解减弱,相应的,p53表达增高。而过表达RNF126明显提高了p53的泛素化,提示p53的泛素化降解增强,相应的p53表达降低。结论:1、RNF126不能调控突变型p53的蛋白表达;2、RNF126对p53-p21表达调控发生在转录后水平。可以通过泛素化降解途径调控野生型p53的表达,进而调控下游p21和p Rb的表达。第三部分:RNF126对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及化疗药物敏感性的调控目的:在体外,探究RNF126对于结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗药物敏感性的调控作用。在体内,通过裸鼠皮下成瘤实验进一步验证RNF126对结直肠癌的作用。研究方法:通过transwell法来研究RNF126的沉默和过表达对于结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力的影响。通过MTT法观察RNF126的沉默和过表达对细胞增殖的作用。通过流式细胞技术,检测RNF126的沉默或过表达对结直肠癌细胞的细胞周期的调控作用。再次通过MTT法观察RNF126的沉默和过表达对于结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的调控作用。构建RNF126沉默的稳定转染细胞系,通过裸鼠成瘤实验观察RNF126在体内实验中对结直肠癌的作用。结果:沉默RNF126可抑制HCT116结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,而共沉默p53可逆转上述结果。相反,过表达RNF126可以促进HCT-8细胞的增殖、迁移和侵袭能力,蛋白酶抑制剂MG132可以抑制RNF126过表达对细胞增殖、侵袭、迁移和侵袭的促进作用。此外,沉默RNF126可以降低结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,这一结果同样可以被p53沉默所逆转。相反,过表达RNF126可以增强结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,这一情况同样可以被MG132所逆转。在体内实验,裸鼠成瘤实验结果提示,与对照组相比沉默RNF126的实验组裸鼠移植瘤体积增长明显受到抑制。沉默RNF126的实验组裸鼠移植瘤重量明显小于对照组。结论:1、在表达野生型p53的结直肠癌细胞中,RNF126可以通过促进p53的泛素化降解,调控p21-p Rb通路活性,最终促进CRC的增殖、侵袭、迁移和耐药。2、体内实验提示沉默RNF126对结直肠癌存在抑制作用。