目的:中医学对银屑病并无明确、清晰的记载,只是记载的“白庀”等疾病与银屑病相似。但使用的处方和中药都非常多。从众多的处方中找出共性的东西,对中药治疗银屑病的作用机理和有效成分进行研究,对银屑病的临床治疗和新型安全有效的新的银屑病治疗药物的开发具有重要意义。银屑病是一种慢性的、炎症性皮肤疾病。早在1970年,科学家就发现银屑病患者体内免疫细胞表达增多,提示银屑病的发病过程与免疫功能有关。银屑病患者的先天免疫出现异常,皮损部位免疫细胞(主要是T细胞和树突状细胞)的表达显著增加。研究发现银屑病与免疫级联系统密切相关。因此,本研究以治疗银屑病中药调节T细胞免疫级联网络为切入点,对治疗银屑病中药进行深入研究,揭示其现代内涵,为银屑病的临床治疗和新药开发奠定基础。方法:一、计算机药理学方法预测治疗银屑病中药作用机理查询《中国中西医结合皮肤性病学杂志》2002年1月至2011年10月份发表的中药治疗银屑病的文章,收集完整的处方63首,中药129味。从贝尔斯坦数据库(Reaxys,Beilstein),中国天然产物数据库(CNPD,创腾科技)和北京大学中草药三维结构数据库(3D-MSDT)收集中药中小分子化合物建立数据集。将小分子数据集导入Discovery Studio(2.5.5 version,Accelrys),计算分子量、脂水分配系数、氢键给体和氢键受体四个化学描述符。根据里宾斯基的类药性规则对小分子数据集中的分子进行初步筛选。免疫级联网络中共涉及10个关键的细胞因子,从PDB库下载靶标的三维结构,导入 Discovery Studio(2.5.5 version,Accelrys),去水和杂原子,加氢,备用。采用Discovery Studio(2.5.5 version)中的DS libdock模块对治疗银屑病中药中的小分子与靶标之间的相互作用进行预测。活性位点根据文献报道的活性序列进行定义,其他指标非特别说明均采用默认参数。取打分排名前100位的小分子进行分析。将复方、中药、靶标,以及虚拟筛选的结果输入网络构建与分析软件Cytoscape或Pajek,进行网络的构建与分析。二、出现频率最高的10味中药与6个银屑病治疗靶标的相互作用预测统计各味中药在处方中出现的频率,以出现频率最高的10味中药中的小分子建立数据集;6个银屑病并治疗靶标来自治疗靶标数据库(Therapeutic Target Database),蛋白质三维结构中均有小分子抑制剂。用DSligandfit模块进行半柔性分子对接,以靶标与抑制剂复合物中的配体分子搜索活性位点;Energy Grid选用charm;Number of Monte Trials 设为 5000;Maximum Poses Retained 设为 1;Minimization Algorithm选用 Smart minimizer,Force field 选用 charm,Iteretions设为1000,Gradient Tolerance设为0.001;其余参数均为默认参数。以靶标蛋白与抑制剂复合物中的小分子配体对接分数为阈值,打分高于此阈值的中药小分子即认为具有相互作用。三、网络药理学方法研究银屑灵片调节免疫级联网络的作用及机制(一)银屑灵片调节免疫作用的网络药理学研究1.虚拟筛选银屑灵片中共10味中药,收集到886个小分子的三维结构组成了数据集。10个与银屑病发病密切相关的细胞因子均有已知的蛋白质三维结构可用于虚拟研究。采用DS libdock进行虚拟筛选。2.免疫级联网络的构建与分析以T细胞免疫过程中主要的免疫细胞和细胞因子为节点,它们之间的联系为边,通过生物网络构建和分析软件Cytoscape构建免疫级联有向网络。网络中包括7种免疫细胞和10个细胞因子。以度、中介性、紧密度等8个网络拓扑性质参数对网络中节点的重要性进行分析。3.银屑灵片调节免疫作用机理预测根据计算机虚拟筛选的结果和网络药理学研究结果,对银屑灵片调节免疫的效应靶点和作用机制进行预测。(二)IL-23致小鼠类似银屑病动物模型的建立及优化小鼠用电推剪剪去背部毛发,皮下注射IL-23溶液20 u 1(含IL-23抗原500ng),空白对照组皮下注射等量的PBS溶液。注射时间为第1、2、4天。第5天取材。优化的条件包括小鼠种别、性别,以及造模剂量。(三)银屑灵片对IL-23致小鼠类似银屑病的干预作用研究60只C57BL/6小鼠随机分为6组,雌雄各半。分别空白对照组、模型组、阳性对照组、银屑灵低剂量组,银屑灵片中剂量组和银屑灵片高剂量组。连续灌胃30天,每天1次,灌胃完成后的第1天、第2天和第4天皮下注射IL-23溶液20μ 1(含IL-23抗原500ng),空白对照组皮下注射等量的PBS溶液。第5天取材。四、银屑灵优化方活性成分研究(一)银屑灵优化方有效成分预测通过计算机虚拟筛选,预测银屑灵优化方中对10个细胞因子有活性的化学成分成分。将虚拟筛选的结果输入网络构建与分析软件Cytoscape,进行网络的构建与分析。计算网络的度、中介性等拓扑性质参数,研究靶点的重要性。预测银屑灵优化方中调节作用最强的分子,以及关键的桥梁分子。(二)入血成分研究及有效成分研究成年雄性比格(Beagle)犬,给药前12小时禁食不禁水,采取空白血样注入抗凝管。随后按照9.6g/kg体重灌胃给予银屑灵优化方药液,给药后采血,分离得含药血浆。含药血浆经处理后,用UPLC-Q-TOF/MS对入血成分进行分析。对比入血成分与预测的活性成分,得到预测有活性的入血成分,即可能为银屑灵优化方的活性成分。结果:一、治疗银屑病中药调节免疫级联网络的计算药理学研究(一)复方与中药研究复方中出现频次最高的十味中药依次为生地黄(44)、丹参(28)、土茯苓(26)、赤芍(24)、紫草(22)、牡丹皮(21)、当归(19)、鸡血藤(19)、金银花(17)、白茅根(16)。根据文献报道,这10味中药均具有免疫增强、免疫抑制或免疫调节作用。(二)小分子数据集类药性分析结果经过类药性的初步筛选,共剩下3835个小分子组成数据集。对3835个小分子的中药来源进行分析,共来自106味中药。(三)治疗银屑病的62个处方与10个细胞因子虚拟筛选结果共有772个小分子与10个细胞因子有相互作用。对小分子进行中药来源分析,772个小分子共来源于95味中药,即临床所用的治疗银屑病的处方,绝大部分都可能与免疫级联网络中的细胞因子存在相互作用。有效成分数排前10的依次是红参(46)、山药(32)、甘草(23)、败酱草(22)、地黄(22)、金银花(21)、丹参(20)、蒲公英(20)、桃仁(20)、桑白皮(19)。二、出现频率最高的10味中药作用机理的计算机虚拟研究(一)机理预测虚拟筛选结果显示,10味中药与6个靶标中的5个靶标有相互作用。中药治疗银屑病的作用机理可能包括抑制组织蛋白酶S、嘌呤核苷磷酸化酶、丝裂原蛋白激酶和肿瘤坏死因子的活性,活化PPAR-γ,可从而发挥抗炎和抑制自身免疫的作用,达到治疗银屑病的目的。(二)活性成分预测共有362个活性分子和5个靶标可能存在相互作用,相互作用最强的分子分别来自土茯苓、丹参、牡丹皮和当归。有4个化合物可同时作用于5个靶标,可能具有多靶点作用,分别来源于当归、丹参和牡丹皮。其中来源于丹参的Delphin可以同时作用于5个靶点,同时也是对p38mapk作用最强的成分,来源于牡丹皮的Peonoside也可以同时作用于5个靶点,同时是对PPAR-r活性最强的成分。三、网络药理学方法研究银屑灵片调节免疫级联网络的作用及机制(一)银屑灵片调节免疫作用的网络药理学研究1.计算机虚拟研究筛选出397个潜在活性成分,分别与免疫级联网络中的8个靶标有潜在相互作用;其中IL-17A与其中的260个分子可能存在相互作用,IFN-α与192个小分子有潜在相互作用。IL-17A和IFN-α是预测出的潜在有效成分最多的两个靶标,可能是银屑灵片主要的效应靶点;IL-23和IL-17F未预测出相互作用,可能不是银屑灵片的作用靶点。将每味中药中的潜在活性成分数占总的小分子数的比定义为有效成分指数,银屑灵片中有效成分指数大于0.45的中药分别是:君药中的地黄,臣药中的莪术和紫草,佐药中的土茯苓和乌梅,以及佐药甘草。2.网络药理学研究根据网络重要性分析的结果,IL-23、IL-12是免疫级联网络中的桥梁分子,具有最重要饿作用;其它8个细胞因子的节点重要性综合排名分别是TNF-α、IFN-Y、IL-1 beta、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22和IFN-α。对靶标-分子网络进行研究,IL-17A和IFN-α是银屑灵片靶标-分子网络中最重要的节点,也就是说,IL-17A和IFN-α可能是银屑灵片最主要的效应靶点。对靶标-中药网络进行研究,IL-17A和IFN-a是银屑灵片作用的主要靶点,其次是IL-12和IL-22。银屑灵片方中重要的中药有君药中的地黄、川芎和赤芍,臣药中的紫草,佐药中土茯苓,使药甘草;其次是君药中的赤芍,臣药中的莪术,佐药中的乌梅;重要性最低的是佐药中的金粟兰。3.银屑灵片调节免疫作用机理预测银屑灵片主要通过君药中的地黄、当归、川芎,臣药中的紫草,佐药中的土茯苓,以及使药甘草,作用于免疫级联网络中的IL-17A、IFN-α、IL-12/23 P40亚单位和IL-22等靶点,调节免疫级联网络的平衡,而达到治疗的目的。(二)IL-23致小鼠类似银屑病动物模型的建立及优化C57BL/6小鼠造模较成功,第4天可在非注射部位观察到散布的增厚白点,白点脱落后无出血,可看到红色组织。病理观察提示病变为符合银屑病改变。但是8天后自愈。自愈后再刺激无反应。昆明种小鼠只在注射部位有炎症反应,无明显皮屑和增厚。病理检查符合银屑病病变。8天后自愈。自愈后再刺激无反应。NIH种小鼠只在注射部位有炎症反应,无明显皮屑和增厚。病理检查部分符合银屑病病变。8天后自愈。自愈后再刺激无反应。造模效果具有剂量依赖性,中、高剂量组严重程度打分和阳性率都显著高于低剂量组,中、高剂量组差别不太;小鼠造模效果具有性别差异,雄性小鼠阳性率和打分都明显高于雌性小鼠组。因此,结合实验结果和文献的造模方法,本研究选用C57BL/6进行后续的研究,分别在第1、2、4天皮下注射IL-23(500ng/20μ1)进行造模。(三)银屑灵片对IL-23致小鼠类似银屑病的干预作用研究1.皮肤外观模型组的皮肤病变阳性率和打分的平均分数为80%(1.7分);银屑灵片低、中、高剂量组阳性率和打分的平均分分别为30%(0.6分)、40%(0.5分)、30%(0.2分);阳性对照药物环孢素A的阳性病例出现率和打分为30%(0.2分)。表明银屑灵片各剂量组和环孢素A组都能显著降低病变的阳性率和打分的分值,对IL-23抗原引起的小鼠类似银屑病病变具有较好的干预和预防作用。2.病理检查结果造模组有角质层明显增厚,角化不全多见,典型的munro微脓肿,颗粒层明显变薄,棘层增厚,个别可见基底层增厚或松解破坏;真皮毛细血管扩张、充血,可见红细胞外渗,偶见淋巴细胞、中性粒细胞浸润。病变为符合银屑病改变。银屑灵各治疗组病变与模型组的呈平行改变,高剂量组效果显著,而且颗粒层增加明显,抗角化作用较好;环孢素A组抗炎效果明显,抗角化弱。3.免疫器官重量指数与空白组比,银屑灵片中剂量组脾脏指数增加最多(P<0.01),环孢素A组(P<0.05)也明显增加;与模型组比,银屑灵片中剂量组脾重指数(P<0.01)显著增加。而且银屑灵片中剂量组脾脏指数高于低剂量和高剂量组(P<0.05)。与空白组比,银屑灵片中剂量组胸腺指数(P<0.01)显著增加,而且银屑灵片中剂量高于低剂量组(P<0.05)和高剂量组,说明银屑灵片中剂量组促进免疫作用最好;与模型组比,环孢素A组胸腺指数(P<0.05)显著降低,具有明显的免疫抑制作用。说明银屑灵片与免疫抑制剂环孢素A的作用机理不同,不是通过免疫抑制作用发挥疗效。4.小鼠皮肤中IL-17F、IL-23和IFN-γ表达量的测定结果银屑灵片能显著调低IL-17F(P<0.05)和IFN-γ(P<0.01)的表达量,低剂量调高IL-23(P<0.05)的表达量,而中剂量调低IL-23的表达量。环孢素A能显著调低IL-23(P<0.05)和IFN-γ(P<0.01)的表达量,但是对IL-17F无效。通过结果分析可知,治疗银屑病效果最好的药物是能使各细胞因子的表达量尽量回归正常水平的药物,而非特异性的抑制某个关键细胞因子的药物。银屑灵中剂量组和高剂量能纠正3个细胞因子饿失衡状态,具有较好的预防效果和较小的副作用。中医中药注重整体性,通过其中众多的小分子调节免疫过程中的多个环节,纠正免疫失衡状态,这也可能是中药治疗银屑病发挥疗效较慢,但作用持久,副作用小的根本原因。四、银屑灵优化方活性成分研究(一)银屑灵优化方有效成分预测银屑灵优化方中273个小分子与8个靶标存在潜在的生理作用。按照靶标的重要性排名,前5个靶标分别是IL-17A、IFN-r、IL-22、IL-6和IL-1β。白介素-23P19亚单位(Interleukin-23 P19,IL-23 P19)和白介素-17F(Interleukin-17F,IL-17F)与银屑灵优化方未能预测出相互作用。273个预测的活性成分有117个来自甘草,47个来自紫草,36个来自莪术,32个来自赤芍,25个来自土茯苓,13个来自乌梅,3个来自金粟兰。共有123个成分具有多靶作用。(二)入血成分研究及有效成分研究经与复方、单位中药体内外成分,以及7个对照品的谱图比较,从含药血清中共寻找出银屑灵优化方的34个被直接吸收入血的成分。将入血成分与预测的活性成分进行对比,共有8个入血成分为预测的活性成分,8个成分分别为来自土茯苓的落新妇苷和双氢槲皮素,来自甘草的甘草苷、甘草素和甘草酸,乌梅中含有的柠檬酸,芍药中的芍药苷和芍药苷内酯。其中甘草苷、和柠檬酸能同时作用与3个靶点,落新妇苷可同时作用于2个靶点。据文献报道,8个成分6个具有免疫调节或免疫抑制作用。结论:一、计算机药理学方法预测治疗银屑病中药作用机理通过计算机药理学方法对治疗银屑病的62个处方的作用机理和有效成分进行研究。结果显示临床所用的治疗银屑病的处方,绝大部分都可能与免疫级联网络中的细胞因子存在相互作用。处方中出现频率最高的10味中药,可能通过抑制组织蛋白酶S、嘌呤核苷磷酸化酶、丝裂原蛋白激酶和肿瘤坏死因子的活性,活化PPAR-γ,从而发挥抗炎和抑制自身免疫的作用,达到治疗银屑病的目的。采用计算机虚拟筛选和网络药理学技术对治疗银屑病中药的作用靶标和有效成分进行预测,为下一步的实验提供计算假设。二、网络药理学方法研究银屑灵片调节免疫级联网络的作用及机制通过计算机虚拟筛选和网络药理学预测的作用机制与动物实验的结果具有一致性。网络药理学方法预测银屑灵片可以抑制IL-12/23 P19亚单位的活性,而IL-23和IL-12是网络中的桥梁节点,具有最重要的最优,抑制这两个细胞因子活性后,其下游的细胞因子,如IL-17F、IFN-γ等耳朵表达量都会降低。动物实验结果表明,银屑灵片低、中、高剂量对IL-23抗原引起的小鼠类似银屑病病变有显著的预防治疗效果,而且中、高剂量组能显著调低IL-17F和IFN-γ的表达量。环孢素A能显著调低IL-23、IFN-γ的表达量,但不影响IL-17F的表达,而且环孢素A组三个细胞因子的相对表达量离散程度最大,IL-17F的相对表达量为3.74,IL-23的相对表达量为0.35,IFN-γ的相对表达量仅为0.06,其在发挥治疗作用的同时也表现出了较大的毒性。而银屑灵中、高剂量组能使各细胞因子的表达量尽量回归正常水平的药物,纠正免疫级联网络的失衡状态而发挥治疗效果,而非特异性的抑制某个关键细胞因子的药物,具有较好的治疗效果和较小的毒副作用。三、银屑灵优化方活性成分研究结合计算机虚拟筛选和入血成分研究技术,共找出8个预测具有活性的入血成分,分别为落新妇苷、双氢槲皮素、甘草苷、甘草素、柠檬酸、芍药苷和芍药内酯苷。据文献报道均具有免疫调节或免疫抑制的作用。联合使用计算机虚拟筛选技术和入血成分分析技术可以较快速、有效的从中药复方中筛选出活性成分,并大大的提高筛选的阳性率。与研究预期基本相符。但这8个化学成分具体作用与免疫网络中那个节点,还需要进一步研究。