第一部分引言目前,肿瘤是世界第二大致死性疾病,其发病率和死亡率在持续增加,世界卫生组织最新数据显示,到2020年,预计全球癌症发病率将增加50%。癌症的发病机制十分复杂且尚不清楚,与基因、环境等多种因素有关。最新研究表明,能量代谢紊乱在肿瘤发生发展过程中发挥至关重要的作用,纠正肿瘤能量代谢成为肿瘤治疗的新策略。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(5’-monophosphate adenosine activated protein kinase,AMPK)为细胞的能量感受器,近十年发现可以明显抑制肿瘤。在肿瘤细胞中,即使在有氧条件下,糖酵解途径也是其能量的主要来源,这一现象被称为Warburg效应。最新研究表明,LKB1/AMPK可以调节肿瘤的Warburg效应,但其具体机制尚不明确。线粒体是细胞的能量加工厂,所以AMPK与线粒体之间的关系密不可分。文献表明,增强线粒体的有氧氧化作用,或抑制糖酵解过程,对肿瘤细胞有明显的抑制作用,也有文献报道,AMPK可以抑制Warburg效应。因此我们推测:AMPK可以影响线粒体功能和数目。为了进一步明确其具体作用机制,我们构建了LKB1高表达细胞株A549-LKB1,AMPKβ敲除细胞株A549-LKB1-AMPKβ-Null,以及线粒体AMPKα高表达细胞株A549-mito-AMPKα,并且检测这些细胞线粒体的数目、生物合成、分裂与融合。为了明确AMPK对线粒体功能的影响,本课题组利用乳酸检测试剂盒以及海马代谢仪观察AMPK对肿瘤细胞有氧氧化和糖酵解过程影响的差异。我们还发现敲除AMPKβ后AMPKα的稳定性明显下降,因此也进一步探讨对AMPKα的降解机制。最后,我们还完成了裸鼠成瘤实验,在体内观察了AMPK对肿瘤细胞、线粒体数目、生物合成等过程的影响。第二部分AMPKα、β亚单位在肿瘤细胞线粒体中定位及其对细胞生物学行为的影响目的:检测AMPK的分布及其对肿瘤的作用。方法:选择A549-LKB1细胞,利用Crispr/Cas9技术敲除AMPKβ;选择野生型A549细胞,利用慢病毒在线粒体中特异性高表达AMPKα,并筛选稳定细胞株。Western blot检测其表达量鉴定细胞株是否构建成功;Western blot检测AMPKβ在胞浆和线粒体的分布;MTT和细胞计数法评估AMPKβ和线粒体AMPKα对细胞增殖的影响;划痕实验检测AMPKβ和线粒体AMPKα对细胞迁移的影响;平板克隆实验检测AMPKβ和线粒体AMPKα对细胞克隆形成能力的影响。结果:Western blot结果表明:细胞株构建成功,AMPKβ在细胞株中被成功敲除;而线粒体AMPKα明显高表达。AMPKβ在A549-LKB1细胞中,胞浆和线粒体均表达AMPKβ,AMPKβ敲除细胞(命名为A549-LKB1-AMPKβ-Null),胞浆和线粒体均未见AMPKβ表达。相对A549-LKB1细胞而言,AMPKβ缺陷型细胞的增殖、迁移和克隆能力均明显增强;而相对A549-mito-RFP细胞,线粒体AMPKα特异性高表达的细胞中(A549-mito-AMPK),其增殖和克隆能力明显减弱。结论:首先,我们成功构建实验所需AMPKβ敲除细胞株A549-LKB1-AMPKβ-Null和线粒体特异性高表达AMPKα的细胞株A549-mito-AMPK。然后对细胞株进行行为学检测,发现AMPKβ可以抑制细胞的增殖,迁移与克隆形成能力,线粒体上AMPK也同样有相同的作用,可以抑制细胞的增殖迁移与克隆形成能力。第三部分AMPKα和β对线粒体的影响1.AMPKα、AMPKβ亚单位对线粒体数目的影响目的:检测胞浆内AMPKα、AMPKβ亚单位以及线粒体特异性结合AMPKα对线粒体数目的影响。方法:使用遗传工程将编码Cytochrome C的线粒体定位肽段的寡核苷酸片段置于RFP或活性突变体的氨基段(mito-RFP,mito-AMPK),重组DNA克隆岛Tet-off慢病毒表达系统,建立细胞株。荧光定量PCR法检测A549-LKB1-AMPKβ-Null,A549-LKB1,A549-WT,A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞株的线粒体DNA的相对表达量。Western blot检测线粒体标志性蛋白ATP合成酶Ⅴ表达量;线粒体特异性染料Mito Tracker-Red染色后利用激光共聚焦显微镜观察红色荧光强弱评估线粒体的数量的;最后AMPK持续激活的腺病毒Adn-AMPK-CA和对照病毒Adn-GFP感染A549-LKB1-AMPKβ-Null和549-LKB1两种细胞,48小时后荧光定量PCR法检测线粒体DNA的相对表达量。结果:结果显示,A549-LKB1细胞株其线粒体DNA的相对表达量,线粒体蛋白质量和ATP合成酶Ⅴ的蛋白表达量明显高于A549-WT细胞;A549-LKB1-AMPKβ-Null线粒体DNA的相对表达量,线粒体蛋白质量和表达ATP合成酶Ⅴ的蛋白表达量较A549-LKB1明显下降。再者,我们发现A549-LKB1细胞的大小明显大于其他两种细胞。Adn-AMPK-CA腺病毒感染A549-LKB1-AMPKβ-Null和A549-LKB1细胞后,两种细胞线粒体DNA的相对表达量均明显上升,A549-LKB1细胞的效果更明显。特异性染料Mito Tracker-Red染色发现:A549-LKB1细胞的红色荧光更强;A549-mito-AMPK和A549-mito-AMPK+DOX细胞株的线粒体染色结果无明显差异;A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞大小也无明显差异。结论:A549-LKB1细胞中线粒体数目,线粒体蛋白质量以及线粒体特异性标志物ATP合成酶Ⅴ明显高于野生型细胞,敲除AMPKβ会反转这种变化。转染AMPKα持续激活腺病毒可以增加线粒体数目,线粒体蛋白质量以及线粒体特异性标志物ATP合成酶Ⅴ的量。A549-mito-AMPK和A549-mito-AMPK+DOX两者的线粒体数目和蛋白表达量未见显著性差异。证明AMPK可以增加线粒体数目,而线粒体特异性结合的AMPK却没有这个作用。2.AMPKα和β对线粒体生物合成的影响目的:检测AMPKα和AMPKβ以及线粒体AMPKα对线粒体生物合成的作用。方法:利用荧光定量PCR检测A549-LKB1-AMPKβ-Null,A549-LKB1,A549-WT,A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞株线粒体的生物合成指标PGC1α和Nrf-1表达量。AMPK持续激活的腺病毒Adn-AMPK-CA和对照病毒感染细胞,用激活剂二甲双胍(10 m M)和黄连素(1 m M)处理细胞24小时后提取上述细胞的蛋白进行Western blot实验,检测AMPK的激活情况及线粒体生物合成相关蛋白PGC1α和Nrf-1蛋白的表达量。DOX(2μl/ml)处理A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞后Western blot检测Nrf-1的表达。用腺病毒感染B16细胞,48小时后Western blot检测Nrf-1的表达量。结果:q PCR和Western blot结果表明:相对A549-LKB1-AMPKβ-Null而言,A549-LKB1细胞PGC1α和Nrf-1 m RNA和蛋白表达水平均明显升高;AMPK持续激活的腺病毒或者二甲双胍和黄连素处理后,在两种细胞中,PGC1α和Nrf-1表达量均有上升,A549-LKB1细胞效果更明显。并且,黑色素瘤B16细胞也获得类似结果。但是,A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞Nrf-1的m RNA表达量未见明显差异。DOX处理A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK两种细胞24小时后,RFP和外源性AMPK的表达量下降,Nrf-1的m RNA表达量也未见明显下降。结论:(1)AMPKα,β均可以增加线粒体的生物合成过程。(2)线粒体特异性AMPKα不影响线粒体的生物合成。3.AMPKα和β对线粒体分裂融合的影响目的:检测AMPKα和AMPKβ及线粒体AMPKα对线粒体分裂融合的影响。方法:利用荧光定量PCR检测A549-LKB1-AMPKβ-Null,A549-LKB1,A549-WT,A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞株线粒体的融合指标MFN-1和MNF-2的表达量。用AMPK持续激活的腺病毒Adn-AMPK-CA和对照病毒Adn-GFP感染A549-LKB1-AMPKβ-Null,A549-LKB1和B16三种细胞,或者用AMPK激活剂AICAR(1 m M)处理细胞A549-LKB1和A549-WT细胞,用二甲双胍(10m M)处理A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞,不同时间后提取蛋白进行Western blot实验,检测AMPK的激活情况以及线粒体分裂相关蛋白Drp1的磷酸化水平。DOX(2μl/ml)处理A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞,提取蛋白Western blot法检测p-Drp1表达的情况。结果:荧光定量PCR显示,A549-LKB1细胞MFN-1和MNF-2 m RNA表达量明显低于A549-LKB1-AMPKβ-Null和A549-WT。Western blot的结果表明,AMPK持续激活的腺病毒或者二甲双胍和AICAR药物处理后,p-Drp1的表达量在A549-LKB1细胞明显升高;B16细胞经AMPK-CA腺病毒感染后,也得到了类似的结果。但是,AICAR处理549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞后,p-Drp1的蛋白表达量未见明显下降。结论:(1)AMPKα,β促进线粒体分裂,抑制线粒体融合。(2)线粒体特异性AMPKα不影响线粒体分裂和融合过程。第四部分AMPKα和β对细胞能量代谢的影响目的:检测AMPKα和AMPKβ及线粒体特异性定位AMPKα对细胞能量代谢的影响。方法:利用乳酸检测试剂盒检测A549-LKB1-AMPKβ-Null,A549-LKB1,A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞培养基乳酸的含量;利用糖酵解压力检测试剂盒通过海马能量检测仪检测A549-LKB1-AMPKβ-Null和A549-LKB1细胞糖酵解能力及A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞糖酵解和有氧氧化的能力。结果:A549-mito-RFP细胞培养基中的乳酸含量明显高于A549-mito-AMPK细胞;而A549-LKB1-AMPKβ-Null细胞培养基中的乳酸含量明显低于A549-LKB1细胞。糖酵解压力测试结果显示,A549-LKB1-AMPKβ-Null细胞的糖代谢基础更低,糖酵解最大值更低;检测A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞糖酵解和有氧氧化的基础值时发现,A549-mito-AMPK细胞基础OCAR明显高于A549-mito-RFP细胞,ECAR值相反。结论:线粒体AMPKα抑制糖酵解过程,促进有氧氧化过程。A549-LKB1-AMPKβ-Null细胞的糖代谢低于A549-LKB1细胞,提示细胞浆中的AMPK在葡萄糖至丙酮酸的代谢途径中,发挥重要作用。在该细胞中,需要进一步确立供能途径第五部分AMPKβ对AMPKα稳定性的影响目的:研究AMPKβ对AMPKα稳定性的影响及其机制。方法:Western blot法检测A549-LKB1-AMPKβ-Null,A549-LKB1和A549-WT细胞中AMPKα的表达水平以及感染腺病毒Adn-AMPK-CA和对照病毒Adn-GFP后总的AMPKα以及线粒体中AMPKα的表达。蛋白酶抑制剂和自噬溶酶体抑制剂3-MA,MG132,leupeptin等多种药物处理细胞后,Western blot法检测AMPKα的稳定性。3-MA处理不同时间后,观察与自噬过程的相关指标变化情况。Western blot法检测亚胺环己酮处理细胞后AMPKα的降解情况。结果:A549-LKB1-AMPKβ-Nul细胞,AMPKβ表达量下降,同时AMPKα的表达量也下降。转染AMPKα高表达腺病毒后,AMPKα表达量明显上升,但低于A549-LKB1细胞。用蛋白酶体和自噬溶酶体抑制剂3-MA,MG132等多种药物处理细胞后,只有3-MA可以提高AMPKα的表达量,同时细胞自噬标志蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显增高。亚胺环己酮对外源性AMPKα的表达也有促进作用。结论:AMPKβ影响AMPKα的稳定性。当AMPKβ被敲除后,AMPKα主要通过自噬溶酶体途径降解。第六部分AMPKα对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响目的:检测AMPKα和线粒体AMPKα对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。方法:将A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK细胞接种于4~5周的雄性裸鼠皮下,测量小鼠肿瘤的大小;39天后处死动物后取肿瘤组织并称重,提取蛋白Western blot法检测线粒体生物合成和分裂融合特异性指标的蛋白表达水平。B16细胞接种于C57小鼠皮下,每天黄连素或生理盐水灌胃,测量肿瘤大小,20天后处死老鼠后取肿瘤组织,称重,IHC和Western blot法检测线粒体生物合成和分裂融合的特异性指标的表达水平。结果:接种A549-mito-RFP和B16细胞的对照组,其肿瘤体积和重量明显大于A549-mito-AMPK和B16黄连素处理组。在B16黄连素处理组中,p-Drp1和PGC1α表达量明显高于生理盐水组,而A549-mito-RFP和A549-mito-AMPK中没有差别。结论:AMPKα和线粒体AMPKα均可抑制体内肿瘤细胞的生成。第七部分结论AMPK作为公认的能量感受器和肿瘤抑制因子,其在线粒体和胞浆中均有表达,而且不论是在体内还是体外,线粒体上AMPK和AMPK对肿瘤均有抑制作用。经过实验验证,AMPK可以增加线粒体数目,促进线粒体生物合成和线粒体分裂,抑制线粒体融合,在代谢方面,AMPK对葡萄糖降解起重要调节作用;线粒体上AMPK不影响线粒体数目,对线粒体生物合成,线粒体分裂融合也不存在调节作用,但是在代谢方面,线粒体上AMPK对细胞有氧氧化有促进作用。综上所述,AMPK存在于线粒体和胞浆中,并且各司其职,协同发挥对肿瘤的抑制作用。