水稻是全球重要的粮食作物。冷害是影响水稻产量最主要的非生物胁迫因子之一。因此研究水稻耐冷性遗传机理具有重要意义。越来越多的研究表明,micro RNA是一类以m RNA为靶标对其进行负调控的非编码RNA,广泛参与植物体各种逆境胁迫响应途径。东乡野生稻是迄今发现全球分布最北的普通野生稻,耐冷性极强,是培育耐冷性水稻新品种的重要种质资源。Micro RNA是否参与调控东乡野生稻耐冷性并不清晰。为此,本研究利用Illumina测序技术获得东乡野生稻中micro RNA序列,通过生物信息学方法,筛选出受冷胁迫影响的micro RNA,并对其进行分析及功能验证,以期为在micro RNA层面探究东乡野生稻耐冷机制奠定基础。主要研究结果如下:1.micro RNA文库高通量测序数据分析以东乡野生稻15日龄幼苗为材料构建s RNA文库,经Illumina高通量测序获得了高质量的clean reads数为4940252,以mi Rbase数据库(14.0)中的micro RNA序列的前体和成熟体为参照,经过序列比对,总共鉴别出了93种保守micro RNA。其中reads数排前五位的是osa-mi R159(29637),osa-mi R396(15505),osa-mi R166(4974),osa-mi R156(1771)和osa-mi R164(1209)。此外,根据micro RNA对应的水稻基因组序列能否形成卡环二级结构及其自由能,分析预测出了354个新的micro RNA;2.micro RNA靶基因预测及耐冷相关micro RNA筛选每种micro RNA靶基因预测软件的设计原理的不同,这样会导致同样的micro RNA靶基因预测的结果不完全一样,因此取多种软件针对每个micro RNA预测的靶基因的交集是较为可信的策略。本文采用的靶基因预测软件分别为在线预测软件ps RNAtarget(http://plantgrn.noble.org/ps RNATarget/)和本地化软件Targetfinder,然后用自编perl程序,取得1994个两种软件共预测的靶基因,将这些靶基因序列导入在线软件Blast2go对其进行GO注释及KEGG注释。在所有KEGG注释获得的pathway以及所有的GO注释结果中,经过查询文献,利用相关关键字,筛选出与冷相关的pathway及GO结果,使用自编perl程序提取到到相关靶基因,最终获得对应耐冷相关的micro RNA,总共有145个新的及22个保守的micro RNA。3.对筛选到的相关micro RNA的冷处理实验验证以real-time q PCR技术作为验证方法,对随机挑选micro RNA进行验证时发现,数据库中已有记录的mature micro RNA较高,14个有12个得到验证,而通过测序新发现的novel micro RNA中8个没有一个得到验证。经过数据库(mi Rbase14.0)查询,目前为止发现的水稻中的micro RNA总的种类为713个,即测序获得的新的micro RNA中真实存在的应该是极为稀少的。因此最终在筛选结果里的mature micro RNA中挑选序列进行real-time q PCR进行验证。对幼苗进行冷处理后,提取每个时间点的整株总RNA进行反转录及荧光定量PCR,获得了它们随冷胁迫处理时间改变而变化的条状图以表明变化趋势。本文在筛选结果中随机挑选5条进行验证及检测其受冷胁迫表达量的变化情况,这5条序列分别是osa-mi R159,osa-mi R156,osa-mi R394,osa-mi R397,osa-mi R52。其中仅osa-mi R397在处理了6h之后相比3h时间点时,表达量降低到了与对照组相近的水平,osa-mi R156表达量在前三小时较为稳定,在6h时比对照组增加26倍。osa-mi R394表达量逐步上升,6h时间点的表达量是对照组的3.19倍。综上所述,所选的5个micro RNA在东乡野生稻中确实存在并且其表达量受到冷胁迫的影响,通过生物信息筛选的方法找出逆境胁迫相关的micro RNA在对其进行验证并通过real-time q PCR定量分析其表达的研究方法是可行的。