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兰花具有极高的观赏价值和经济价值,市场前景广阔。利用远缘杂交和多倍体诱导相结合创建兰花新资源,对推动兰花育种和进化研究具有重要意义。本研究以建兰×蝴蝶兰和春兰×卡特兰属间杂交后代为材料,研究了影响建兰×蝴蝶兰根状茎增殖分化的因素、属间杂种不活性和异源多倍体资源创建技术,旨在建立异源多倍体育种技术体系。主要研究结果如下:
1.TDZ显著提高建兰×蝴蝶兰根状茎增殖率和分化率,NAA显著提高根状茎的增殖率和绝对增长率。在MS+TD20.02 mg·L-1+NAA0.50 mg·L-1的培养基上,根状茎增殖率为335.36%、绝对增长率为376.67%。添加椰子汁对根状茎增殖率和芽分化率无显著影响。分步培养显著提高了建兰×蝴蝶兰根状茎的芽分化率和成苗率。将根状茎接入MS+TD20.02 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1的液体培养基中振荡培养30 d后,转到含AC0.30 g·L-1和TD20.02 mg·L-1的MS固体培养基培养60 d,芽分化率和成苗率分别达到162.50%和64.42%。
2.建兰×蝴蝶兰试管苗移栽后30 d和60 d的死亡率有显著差异,移栽后60 d的死亡率为24.04%,其中83.41%因干枯黄化而死。移栽的试管苗干枯黄化先由老叶开始,逐渐蔓延至新叶,最后整株苗死亡。杂种无根苗在生根培养基上培养30 d和60 d的死亡率差异也显著。培养60 d的死亡率为20.00%,均因黄化褪绿而死亡,死亡过程和移栽苗的类似,植株死亡后可长出根状茎。施用1%兰菌王和15%生物肥显著提高移栽苗存活率和长新叶率,其中兰菌王效果最佳,移栽苗成活率和长新叶率分别为83.33%和50.00%。
3.秋水仙素处理时间和二甲基亚砜浓度均对建兰×蝴蝶兰根状茎死亡率及增殖率影响不显著,但处理时间越长,死亡率越高。所有秋水仙素处理都成功诱导根状茎染色体加倍,添加1.4%二甲基亚砜的0.05 g·L-1秋水仙素中处理根状茎2d,效果最好,根状茎存活率为52.65%,多倍体诱导率达到25.00%。建兰×蝴蝶兰及其母本小桃红根状茎经0.05 g·L-1秋水仙素处理3d后,增殖率和死亡率无显著差异,但小桃红的存活率和四倍体诱导率均高于建兰×蝴蝶兰。
4.建兰×蝴蝶兰二倍体、四倍体及母本根状茎的增殖率差异显著,其中二倍体最高,四倍体最低。三种材料根状茎的芽分化率无显著差异,成苗率差异显著,母本最高,四倍体的最低。三种材料试管苗的鲜重、叶长、叶宽差异显著,四倍体最粗壮、叶片最宽,母本叶片最长。移栽30 d后,二倍体、四倍体和母本试管苗的死亡率分别为40.00%、77.78%和17.14%。
5.春兰×卡特兰二倍、四倍和六倍体根状茎的死亡率和增殖率差异显著。六倍体的死亡率和增殖率最高,四倍体增殖率最低,二倍体死亡率为0.00%。春兰×卡特兰四倍体根状茎明显增粗、颜色变深,六倍体根状茎端部短圆。二倍、四倍和六倍体的根状茎芽分化率和成苗率差异显著,四倍体根芽分化最协调,芽分化率和成苗率分别为58.33%和68.24%,六倍体的最低,仅为16.67%和10.00%。春兰×卡特兰四倍体试管苗的鲜重、株高、叶长、叶宽和根长显著高于二倍体。六倍体试管苗生长缓慢,植株更加矮壮、叶片短圆。二倍体和四倍体试管苗移栽30d后,死亡率分别为32.00%和8.70%。
通过上述研究,初步明确了兰花属间杂种不活性,获得了兰花异源多倍体和小桃红四倍体资源,弄清了兰花异源多倍体根状茎的组培特性。为进一步开展兰花异源多倍体育种和进化研究奠定了基础。