论文部分内容阅读
光学纯2-辛醇是光电材料、医药、农药和精细化工产品的重要手性中间体。通过开展生物法催化高效制备光学纯2-辛醇,对于取代现有的化学法以及深入手性生物催化的研究具有重要的现实意义和理论价值。本文从包括酵母、细菌和霉菌在内的菌株中筛选得到还原2-辛酮生成手性2-辛醇效果较好的2株菌株。其中Candida boidinii CECT 10035能够还原2-辛酮得到(S)-2-辛醇,当底物浓度为10g/L时,转化率为32.6%,e.e.值为95.6%。另一株Oenococcus oeni CECT 4730则是能还原2-辛酮得到(R)-2-辛醇,在同样底物浓度下,转化率为99.8%,e.e.值为97.6%。酒明串珠菌具有较高的酮还原能力以及光学选择性,是首次报道。对Oenococcus oeni CECT 4730催化还原2-辛酮的反应体系进行研究,优化其反应体系及反应条件为:细胞浓度250g/L,底物浓度0.5M,采用葡萄糖作为辅助底物,浓度为300mM,水相为300mM Tris-Borate (TBE)缓冲液,pH为8.5,有机相为正壬烷,两相比为1:1,摇瓶转速为150rpm,反应温度30℃,反应48小时,在培养菌体过程中通CO2,同时反应前通惰性气体N2作为保护气,并保持厌氧。在最优条件下,产物的光学纯度提高至99%e.e.,转化率保持99%。在以上优化过程中发现高浓度的底物,辅助底物和TBE缓冲液对反应有抑制,因此采用底物流加反应来降低以上因素对反应的抑制。其流加反应体系为:流加过程中细胞浓度为180g/L,维持底物浓度为10g/L左右,同时将出发的TBE缓冲液pH改为7.5,流加过程中维持pH在7.5附近,流加中用于调节pH的Tris液浓度为0.3M,辅助底物葡萄糖也是0.3M。经过48小时的流加反应,产物浓度达到120g/L,并且转化率和e.e.值均达到99%。利用Oenococcus oeni CECT 4730还原不同酮化合物,发现其胞内的醇脱氢酶具有较广的底物特异性,即能还原脂肪酮类化合物,又能还原芳香酮类化合物,并且产物的光学纯度都较高。在酮底物的选择性上,尤其适合于还原在羰基一侧具有一个甲基,在另一侧有一个较大基团的酮化合物。通过对其粗酶的研究发现,其胞内的醇脱氢酶是NADPH依赖型的,并且在还原辅酶过程中的一个关键的酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。还研究了Oenococcus oeni CECT 4730在还原反应过程中的辅酶循环系统,其主要通过PK途径代谢葡萄糖并用于再生辅酶,并且大约一分子的葡萄糖被代谢,就会再生二分子的NADPH用于还原2-辛酮生成二分子2-辛醇,同时产生一分子的乳酸和乙酸。针对辅酶再生体系的特性,发现添加离子和乙醇会提高其辅酶再生体系的转化效率,通过反应优化,确定在反应体系中添加2.5mM的Mn2+和Fe2+,以及10mM的乙醇。优化后,单批次反应的转化能力比之前的单批次优化结果又提高50%。最后利用Candida boidinii CECT 10035全细胞催化手性合成(S)-2-辛醇,将其反应体系及反应条件优化为:细胞浓度200g/L,底物浓度8g/L,反应pH为8,反应温度33℃,反应48小时,装液量为20%。优化后产物的光学纯度提高至96.1%e.e.,转化率提高至47.8%。