论文部分内容阅读
前言：
肿瘤是典型的血管依赖性病变,其必须建立自己的血管网络从而打破宿主内在微环境的平衡进行生长、浸润和转移。血管生成拟态(vasculogeniemimicry,VM)的提出丰富了肿瘤血管生成理论,其特点是在人眼葡萄膜黑色素瘤中可以看到无内皮细胞的管道,管道内壁没有血管内皮细胞衬覆,肿瘤细胞模仿机体血管生成在管壁外表面排列取代内皮细胞构成血供通道,管道内可见流动的红细胞。我们在细胞病理学中发现肺源性非小细胞肺癌(NSCL)患者胸腔积液离体后进行石蜡包埋切片后肿瘤细胞之间互相连接形成中空管腔样结构,我们将这样的结构成为“肿瘤细胞血管样管型”,并推断NSCLC胸腔积液在缺少细胞外基质支持和缺氧的条件下肿瘤细胞为了自身的生存,便于营养物质的交换、代谢甚至是再转移也可以分化成肿瘤细胞血管管型的形态担当起血管和淋巴管的功能,对离体的肿瘤细胞提供营养和氧气。
目的：
探讨肿瘤细胞血管管型与组织及细胞系中VM之间的区别和联系。证明肿瘤细胞血管管型结构是否具有血管及淋巴管内皮标记物的表达,并将观察到的管腔结构进行形态分类。建立裸鼠肿瘤模型,在组织学水平进一步证实肿瘤细胞血管管型的存在。
材料与方法：
1、材料
收集2010年1月至2011年12月中国医科大学附属第一医院门诊及病房胸腔积液,优选以肿瘤细胞为主、炎性细胞较少(肿瘤细胞约占整张切片的95%以上)未接受过治疗的100例NSCLC胸腔积液作为研究对象(经临床表现、CT、MR等临床资料及41.5%的患者进一步做肺部肿瘤进行肺穿后进组织病理学诊断为NSCLC,另外100例良性胸腔积液标本作为对照。这50人中男性为104人,女性为96人,年龄从30岁至82岁,平均年龄均为61岁。
2、液基细胞薄层检测技术(TCT):
收集新鲜胸水20ml左右,室温下800r/min离心5分钟,弃去上清,取沉淀底层细胞,加入清洗液后再次离心。取沉淀与保存液混合后机器Thinprep2000自动制片。
3、免疫细胞化学染色
CD31(SC-71872)、CD105(SC-2048)、CD34(SC-65261)、D2-40(SC-50415)、LYVE-1(SC-31290)、TTF-1(SC-53136)、CK5&6(SC-60041)、CK7(SC-35155)均购自美国SantaCruz公司,CDl33(130-094-913)购自德国美天旎公司。采用链霉菌抗生物素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)法,PBS缓冲液代替第一抗体作为空白对照,DAB显色,苏木素复染。常规脱水透明,中性树胶封片。
4、免疫荧光染色方法
免疫荧光双染法法检测CD31、CD34、CDl05、D2-40、LYVE-1的表达定位。将选出的切片放于69℃烤片机上2小时,后二甲苯中脱蜡,酒精脱苯,高温高压法进行抗原修复。非免疫动物血清37℃封闭30分钟,滴加一抗(1:100稀释,选择不同二抗的一抗按1:1比例两两混合),4"孵育过夜;免疫荧光二抗(1:500稀释,不同种属二抗按1:1两两混合),,37"C孵育30分钟。DAPI复染细胞核。50%缓冲甘油封片,荧光显微镜Nikon90i下观察并照相。孵育二抗以后步骤均在避光条件下进行。阴性对照实验:用等量的0.01mol/LPBS代替一抗,其余步骤同前。结果判定:以细胞胞浆中呈现明亮的绿色和红色荧光信号,合成后为黄色的荧光信号定位为阳性。
5、WestemBlot蛋白印迹
检测血管及淋巴管上皮因子的表达水平。在70例NSCLC患者胸腔积液,30例炎性及增生胸腔积液中检测CD31、CD34、CDl05、LYVE-1的蛋白水平。蛋白从胸腔积液细胞中提取,冰上超声处理,4℃静置,孵育50min,4℃离心20min(800r/min),提取上清,放入-70℃冰箱里保存。使用前用Brodford法测定蛋白浓度,每孔80μg蛋白加入10%SDS-PAGE凝胶电泳后,40V(LYVE-1)、80V(CD31、CD34、CD105)条件下湿电转移仪将蛋白转入0.22μmPVDF膜,5%脱脂奶粉封闭液封闭2h,一抗(1:100稀释)4℃过夜,后用TTBS沈膜,二抗(1:1000稀释),X底片曝光,显影,定影后拍照,以β-actin为内参,用凝胶成像及分析系统(BiolmagingSystems,美国)分析蛋白各条带的灰度值,每组结果均为相同条件重复3次。Westernblotting试验中使用的试剂包括:CD31(SC-71872)、CDl05(SC-2048)、CD34(SC-65261)、LYVE-1(SC-31290)均购自美国SantaCruz公司。
6、裸鼠NSCLC胸腔积液移植肿瘤动物模型
雌性BALB/C裸鼠24只,4～6周龄,体重18～24g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,裸鼠在恒温18～22℃、恒定湿度(50～80%)的SPF层流罩中饲养,自由摄入无菌的标准饲料和无菌水,合格证编号2007000519646。将诊断为非小细胞肺癌患者胸腔积液中肿瘤细胞进行细胞计数后移植到裸鼠背部皮下,并于1天、3天、7天、14天解剖取出肿瘤包块进行HE染色及免疫组织化学染色。
7、肺源性非小细胞肺癌患者肺穿后固定包埋,HE染色
8、统计分析
各组资料利用SPSS13.0进行统计分析。P＜0.05有统计学意义。
结果：
NSCLC患者胸腔积液TCT中均发现紧密彩球状、鳞片状或是灯泡状聚集的肿瘤细胞,对阳性标本包埋、切片HE染色后可观察到单个、两个甚至多个肿瘤细胞组成的血管样管型结构,并将发现的血管样结构归纳为13种形态结构;血管、淋巴管内皮因子的免疫细胞化学染色、免疫荧光染色、Western-blot结果均为阳性表达;裸鼠肿瘤细胞移植模型在建立的第7天的肿瘤包块可见大量的肿瘤细胞血管管型,并在管型中发现大量红细胞;将NSCLC患者的肺部肿物组织HE染色也发现肿瘤细胞围成的血管样结构。
结论：
细胞病理学和组织病理学一样存在肿瘤细胞为了自身生存互相连接形成的血管管型结构的现象,但是不同于血管生成拟态管道没有血管内皮的观点,肿瘤细胞血管管型可以表达血管及淋巴管内皮标记物。在裸鼠肿瘤细胞移植模型中同样发现了内含大量红细胞的肿瘤细胞血管管型结构。说明肿瘤细胞在缺少营养和养分的条件下可以分化为肿瘤细胞血管样管型,为其生存和转移提供条件。