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研究背景肌腱病(tendinopathy)不仅是一种职业病,也是最常见的运动损伤性疾病,发病率高,是目前足踝外科、运动医学、康复医学等学科常见的伤病之一,严重影响了人们的日常工作与生活。目前的治疗方式主要是保守治疗和手术治疗,保守治疗的方法包括局部制动休息、减负训练、口服甾体类抗炎药、物理治疗,中医疗法、干细胞疗法等;对于保守治疗无效、临床症状持续加重的患者,可予以外科手术治疗。这些保守治疗方式在治疗过程中发生的不良反应多,治疗效果较差。肌腱病的发病机制目前为止还没有一个明确的定论,肌腱的过度拉伸使用和肌腱干细胞的异常分化是肌腱病比较公认的发生机制。富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)局部注射能够有效地促进跟腱组织损伤的修复。但临床上PRP应用不存在明确的定义,因而不同的患者、不同的医师操作会产生不同的效果,甚至出现截然相反的结果,因此完善PRP的临床使用规范是我们迫切需要解决的科学问题。本课题提出了三点假设:第一,在常氧和低氧的条件下,PRP能促进TSCs成腱分化;第二,PRP对兔跟腱病的修复效果具有浓度相关性;第三,PRP对兔跟腱病的修复效果与注射部位(肌腱周围、肌腱组织内)具有相关性。研究目的1.分离、鉴定兔肌腱来源干细胞,并探究不同浓度PRP以及低氧环境下PRP诱导TSCs成腱细胞分化的作用;2.不同浓度PRP注射于相同部位以及相同浓度的PRP注射在不同部位对兔跟腱病模型修复作用的疗效评价。实验方法1.兔肌腱干细胞的分离、培养与鉴定:1周至1月龄新西兰大白兔取双后肢跟腱组织,分离并培养有多向分化潜能的肌腱干细胞,通过克隆平板实验、流式细胞检测技术、免疫荧光检测技术及诱导分化测定肌腱干细胞的自我更新、多向分化能力以及干细胞标志蛋白的表达。2.PRP在低氧环境下诱导TSCs成腱分化的作用;实验分为Ⅰ组(空白对照组)、Ⅱ组(5%PRP共培养组)、Ⅲ组(10%PRP共培养组)、Ⅳ组(20%PRP共培养组)、Ⅴ组(40%PRP共培养组),含不同浓度的PRP的完全培养基与肌腱干细胞共培养14天,通过western blot、RT-PCR技术检测其成腱、成脂、成骨以及成软骨标志蛋白和基因的相对表达量;在常氧和低氧环境下,实验分为低氧组、低氧—PRP组、常氧组、常氧—PRP组,含20%浓度的PRP的完全培养基与肌腱干细胞共培养72小时,通过流式细胞技术检测细胞凋亡情况,Western Blot、RT-PCR技术检测其成腱、成脂、成骨以及成软骨标志蛋白和基因的相对表达量。3.不同浓度PRP对兔跟腱病模型修复的疗效评价:使用I型胶原酶建立兔跟腱病模型,随机将实验兔分为6组:A组(空白对照组)、B组(模型对照组)、C组(5%PRP注射组)、D组(10%PRP注射组)、E组(20%PRP注射组)、F组(40%PRP注射组),其中A组和B组注射等量的生理盐水。在超声引导下将不同浓度PRP精准注射于兔跟腱处,连续治疗4周,取兔跟腱组织通过影像学、组织学、Western Blot和RT-PCR技术,观察跟腱胶原纤维的排列与形态,检测其成腱、成脂、成骨以及成软骨标志蛋白和基因的相对表达量。4.PRP注射在不同部位对兔跟腱病模型修复的疗效评价:随机将实验兔分为4组:a组(空白对照组),b组(20%PRP肌腱内注射组),c组(20%PRP肌腱周围注射组),d组(20%PRP肌腱内联合肌腱周围注射组),其中a组注射等量的生理盐水。在超声引导下将相同浓度的PRP精准注射,连续治疗4周,取兔跟腱组织通过影像学、组织学、Western Blot和RT-PCR技术,观察跟腱胶原纤维的排列与形态,检测其成腱、成脂、成骨以及成软骨标志蛋白和基因的相对表达量。结果1.成功地分离提取出了兔肌腱来源干细胞。分离提取出的细胞具有很高的增值能力,经流式细胞检测技术分析,TSCs表面标志CD29、CD44、CD90表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性。免疫荧光结果显示,TSCs表达SSEA-4、Oct-3、Nanog、Nucleostein呈阳性,分离出的细胞具有向成骨、成脂发现分化的能力。2.各组细胞沿壁贴附生长良好,细胞形态呈长梭型以及多角型,贴壁牢固。在20%浓度的PRP共培养时,肌腱干细胞的CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNC、TNMD蛋白和基因的相对表达量最高,成骨、成软骨及成脂标志基因相对表达量基本无差异,在40%浓度的PRP共培养时,肌腱干细胞的CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNC、TNMD蛋白和基因的相对表达量并未表现为浓度相关性,反而细胞的生长能力降低,细胞形态发生变化,培养液中出现凋亡细胞;结果表明了20%浓度的PRP对TSCs向腱细胞方向分化最为有利,且降低了异常分化的可能。3.在低氧环境下,肌腱干细胞的CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNC、TNMD蛋白和基因的相对表达量是降低的,成骨标志基因相对表达量升高,成软骨及成脂标志基因相对表达量基本无差异。在加入PRP共培养后,相对于低氧环境下CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNC、TNMD蛋白和基因的相对表达量升高,成骨标志基因相对表达量下降,成软骨及成脂标志基因相对表达量基本无差异。结果表明了PRP在低氧环境下,更有利于肌腱干细胞向腱细胞方向分化,纠正了肌腱干细胞的异常分化。4.在相同部位注射等量的不同浓度的PRP后,根据影像学、组织学、分子生物学等检测结果显示,表现为E组跟腱内胶原排列平行、有序,组织内CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNC、TNMD蛋白和基因的相对表达量升高;C组、D组、F组兔跟腱的修复效果与对照组无异,表明20%浓度的PRP对兔跟腱病的修复疗效最佳。5.在跟腱的不同部位注射20%浓度的PRP后,根据影像学、组织学、分子生物学等检测结果显示,表现为d组跟腱内胶原排列平行、有序,组织内CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNC、TNMD蛋白和基因的相对表达量升高;b组和c组兔跟腱的修复效果与对照组无异,表明腱内与腱周联合注射明显优于单独注射。结论1.肌腱干细胞的成功分离与鉴定有利于我们从细胞水平上了解肌腱的病理生理、发病及修复的过程,从而能够更精准有效的治疗肌腱病;2.在常氧和低氧环境下,肌腱干细胞与富血小板血浆共培养有利于肌腱干细胞向腱细胞方向分化,且20%浓度的PRP诱导作用最强;3.富血小板血浆能够有效地治疗肌腱病,且与浓度呈相关性,在20%浓度下,兔损伤肌腱修复的效果最好;4.富血小板血浆治疗肌腱病的效果与注射部位有关,肌腱内与肌腱周围联合注射的治疗效果明显优于单部位注射。