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研究背景乳腺癌和前列腺癌分别是女性和男性最常见的肿瘤类型,同时二者也分别占女性和男性因肿瘤死亡原因的第二位。恶性肿瘤细胞具有特殊的亲骨性,使其易从原发部位转移到骨微环境中,形成一继发骨肿瘤病灶。80%以上的乳腺癌患者和90%以上的前列腺癌患者可发生骨转移。骨转移可导致严重的骨痛、病理性骨折、致命性高钙血症及脊髓压迫等骨相关事件(skeletal related events,SRE)。其中60%的患者可发生病理性骨折,20%的患者可发生高钙血症,而10%的患者可发生脊髓压迫,这些均严重影响患者的生活质量和生存时间。肿瘤骨转移的本质在于肿瘤细胞与骨髓内多种细胞的相互作用。肿瘤细胞分泌甲状旁腺相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHr P)等因子直接或间接作用于并调控成骨细胞或破骨细胞的分化及活性,而后骨基质溶解及骨骼细胞可释放转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等多种因子又进一步促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和血管发生等,形成所谓的“恶性循环”。目前临床上已采用双磷酸盐、RANKL单抗等抗骨质吸收的药物用于肿瘤骨转移的防治,可患者患者的骨痛等症状,但并不能提高患者的生存时间,临床效果仍有待进一步的提高。临床上根据病理学及放射学表现,可将肿瘤骨转移分为溶骨性、成骨性和混合性三种。乳腺癌骨转移通常为溶骨性,而前列腺癌骨转移通常为成骨性。同时应该注意的是,15%~25%的乳腺癌骨转移患者可发生成骨性骨损害。在骨微环境中,肿瘤细胞与成骨细胞、破骨细胞及基质细胞等多种细胞相互作用,影响了正常的由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收间的骨重建平衡。研究表明,肿瘤细胞可分泌骨形态发生蛋白、内皮素1等因子促进新骨的形成。但肿瘤骨转移的详细分子机制仍存在许多不清楚的地方,进一步研究肿瘤骨损害的相关因子具有重要的现实意义。Sema 3A在正常生理状态下对骨重建具有重要的影响。Hayashi等研究发现,成骨细胞分泌的Sema 3A对成骨细胞和破骨细胞分化成熟具有双向调节能力。Sema 3A通过与特异性受体NRP1结合,激活经典wnt/β-catenin通路,促进β-catenin的核转移,进而与TCF/LEF转录因子结合,增强成骨细胞的分化及其介导的骨形成。同时Sema 3A可抑制破骨前体细胞中plexina1-trem2-dap12复合体的形成,下调itam介导的共刺激通路和nfatc1的核表达,进而抑制破骨细胞的分化和其介导的骨吸收。目前sema3a在肿瘤成骨性骨转移中的作用及潜在的机制仍不清楚。sema3a/nrp1信号通路是否参与成骨性骨转移过程中成骨细胞和破骨细胞的分化成熟,还不得而知。本课题通过建立一个模拟肿瘤细胞调控成骨前体细胞、破骨前体细胞分化成熟的体外培养模型,深入研究sema3a在肿瘤介导的成骨性骨损害过程中的作用及具体分子机制。研究方法一、sema3a在不同骨转移类型肿瘤细胞中表达的检测实时荧光定量pcr、蛋白免疫印迹实验、细胞免疫荧光等方法检测sema3a在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞系和前列腺癌细胞lncap、pc-3、c4-2的表达水平,筛选sema3a高表达细胞系。二、sema3a在成骨性肿瘤细胞介导的成骨分化过程中作用利用shrna慢病毒构建sema3a低表达的乳腺癌和前列腺癌细胞系,或采用sema3a特异性中和抗体处理乳腺癌mcf-7和前列腺癌细胞c4-2,制备相应的条件培养基(conditionedmedium,cm),干预成骨前体细胞mc3t3-e1的成骨细胞分化,并进行如下检测:1.利用碱性磷酸酶(alikalinephosphatase,alp)活性检测和alp染色法检测各组细胞alp活性。2.利用茜素红s染色检测各种细胞骨结节矿化形成情况。3.利用qpcr技术检测各组细胞成骨标志基因alp、runx2、col1α1、ocn及osterix的相对表达量。4.利用蛋白印迹法检测成骨前体细胞表面sema3a特异性受体nrp1的表达以及β-catenin的活化。三、sema3a在成骨性肿瘤细胞介导的破骨分化过程中作用利用小鼠单核细胞raw264.7和小鼠骨髓来源巨噬细胞(bonemarrow-derivedmacrophages,bmms)作为破骨前体细胞模型,同样采用shrna慢病毒和中和抗体检测sema3a在成骨性肿瘤细胞介导的破骨细胞分化过程中作用。主要的检测方法:1.利用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,trap)染色检测破骨细胞特异性分化情况。2.扫描电镜检测骨吸收陷窝形成情况。3.利用qpcr技术检测破骨分化标志基因ck、trap及ctr的相对表达量。4.利用western-blot蛋白印迹法检测raw264.7细胞表面nrp1的表达以及itam下游plc的活化。实验结果一、sema3a在不同骨转移类型肿瘤细胞中表达的检测1.在成骨性乳腺癌mcf-7细胞中,sema3a的mrna和蛋白表达水平明显高于溶骨性乳腺癌mda-mb-231细胞;2.在具有明显促成骨能力的前列腺癌细胞c4-2细胞中,sema3a的mrna和蛋白表达水平明显高于lncap和pc-3细胞。二、sema3a在成骨性肿瘤细胞介导的成骨分化过程中作用1.不同骨转移类型乳腺癌细胞对成骨分化的调控作用alp活性及染色、ars染色及成骨标志基因的检测提示:乳腺癌mcf-7细胞可明显促进成骨细胞分化,而乳腺癌mda-mb-231细胞可明显抑制成骨细胞分化。2.shrna慢病毒可有效建立稳定的sema3a低表达mcf-7和c4-2细胞免疫印迹结果显示,shrna慢病毒感染并经嘌呤霉素筛选后,mcf-7和c4-2细胞中sema3a的mrna和蛋白表达水平均明显下降,表明建立稳定的sema3a低表达细胞系。3.sema3a参与乳腺癌mcf-7细胞介导的成骨分化作用sema3ashrna干扰可明显抑制mcf-7细胞cm介导的促成骨分化作用,中和抗体的实验也同样验证了这一结果。4.sema3a参与前列腺癌c4-2细胞介导的成骨分化作用alp活性及染色、ars染色及成骨标志基因的检测提示:sema3ashrna干扰前列腺癌c4-2细胞sema3a的表达后,其肿瘤细胞cm介导的成骨细胞分化明显受到抑制。5.肿瘤细胞来源的sema3a通过nrp1作用于成骨细胞,并促进wnt/β-catenin通路的活化shrna慢病毒干扰mcf-7细胞中sema3a的表达后,其对mc3t3-e1细胞上特异性受体nrp1的刺激作用明显低于mcf-7cm组。mcf-7cm组和mcf-7nccm组可明显促进成骨前体细胞细胞核中β-catenin的蛋白水平;干扰mcf-7细胞sema3a的表达后,细胞核中β-catenin的蛋白水平明显降低,而胞浆中p-β-catenin的蛋白水平明显升高。三、Sema3A在成骨性肿瘤细胞介导的破骨细胞分化过程中作用1.乳腺癌MCF-7细胞可促进RAW264.7细胞的破骨分化MCF-7细胞CM可明显促进RAW264.7细胞CK、TRAP、CTR三个破骨分化标志基因的mRNA表达;TRAP染色结果也具有相同的趋势。2.Sema 3A减弱MCF-7 CM介导的破骨细胞分化和骨吸收实时荧光定量PCR结果显示,干扰MCF-7细胞中Sema 3A的表达后,可进一步增强MCF-7细胞对RAW264.7细胞CK、TRAP表达的促进作用;TRAP染色结果显示,干扰MCF-7细胞中Sema 3A的表达后,可进一步增强TRAP阳性多核细胞的数目;骨吸收陷窝SEM结果显示,干扰MCF-7细胞中Sema 3A的表达后,可进一步增强MCF-7 CM介导的骨吸收。BMM的实验结果具有相同的变化趋势。3.Sema 3A促进破骨前体细胞NRP1的表达,抑制PLCγ的磷酸化水平抑制MCF-7细胞中Sema 3A的表达后,其对NRP1表达的促进作用明显减弱。RAW264.7细胞中PLCγ的磷酸化水平与RANKL的诱导呈时间依赖关系。抑制MCF-7细胞中Sema 3A的表达后,PLCγ的磷酸化水平明显增高。结论本实验分析了不同骨转移类型(成骨性、溶骨性和混合性)乳腺癌和前列腺癌细胞中Sema 3A这一作为骨代谢重要因子的表达情况,并探讨其对肿瘤成骨性骨转移病理过程中成骨细胞、破骨细胞分化和活性的调控作用。主要的结论如下:1成骨性骨转移肿瘤细胞(MCF-7和C4-2)具有较高的Sema 3A表达水平,而溶骨性骨转移肿瘤细胞(MDA-MB-231和PC-3)中Sema 3A的表达水平较低;2成骨性肿瘤细胞分泌的Sema 3A,可作用于成骨前体细胞上特异性受体NRP1,增强成骨前体细胞内β-catenin的活性,促进成骨细胞的分化和其介导的骨形成。3肿瘤细胞来源的Sema 3A作用于破骨前体细胞上NRP1受体,抑制RANKL介导的ITAM共刺激通路和下游PLCγ的活化,进而抑制破骨细胞分化和骨吸收活性。综上,肿瘤细胞来源的Sema 3A通过对骨微环境中成骨细胞和破骨细胞的双向调控作用,其可能促进了肿瘤成骨性骨转移的进展。