犬附红细胞体形态学观察及PCR诊断方法的建立

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犬附红细胞体病是由犬附红细胞体寄生在犬红细胞膜上、骨髓及血浆中,引起感染犬贫血、发热、黄疸及渐进性消瘦等症状,犬附红细胞体是一种人兽共患病,严重制约了我国养犬业的发展。目前在兽医临床中对于犬附红细胞体病的诊断主要是通过镜检法,包括鲜血压片法及血涂片染色法,但误诊情况较多,急需建立一种高效且特异的检测方法用于临床诊断。本研究主要包括两方面内容:犬附红细胞体形态学观察及PCR诊断方法的建立。形态学观察主要是通过收集感染犬新鲜血液进行染色镜检及制备超薄切片进行透射电镜观察,对犬附红细胞体形态、结构进行研究,结果显示犬附红细胞体既可附着在红细胞表面,又可游离在血浆中,具有多形性,呈杆状、逗点状、环形;既含有RNA,又含有DNA结构;直径在0.3-2.0μm之间,为一单层限制性膜包裹的圆形结构,包裹核糖核蛋白体,无明显细胞器,无核样结构,为典型的原核生物,并通过在临床治疗中使用肌肉注射土霉素注射液,同时根据感染犬不同个体情况和临床症状使用支持疗法对症治疗,取得了不错的治疗效果,治愈率约为80%,使用该方法可有效降低感染犬的死亡率。另根据GenBank中已经发表的不同物种附红细胞体的16S rRNA基因序列进行同源性比对,取其保守区域设计特异性引物,建立犬附红细胞体PCR诊断方法,结果显示该方法可以从阳性血液样本中扩增出530bp大小片段,与预期结果一致,经特异性实验验证该方法只能从犬附红细胞体扩增出与目的片段一致的条带,而健康犬血液、犬弓形虫、犬细小病毒、大肠杆菌均未扩增出目的片段,敏感性实验表明该方法的最低检测量为8pg。使用建立的PCR检测方法对临床收集病例的血液样本进行检测,结果显示对15份经瑞氏染色为疑似阳性血液样本进行PCR检测后,共检出11份阳性样本,阳性率约为73%;对26份经瑞氏染色诊断为阴性血液样本进行PCR检测后,共检出5份阳性样本,阳性率约为20%,以上检测为PCR阳性的犬最终确诊为犬附红细胞体感染,证实该PCR方法对附红细胞体的检出率优于瑞氏染色法。本实验建立的PCR方法具有快速、特异性好,敏感性高等优点,可用于犬附红细胞体病的诊断及流行病学调查,对了解犬附红细胞体病的病原学及流行病学,指导临床治疗和预防具有重要意义。
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