皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC,简称皮肤鳞癌)是常见的皮肤恶性肿瘤之一,发病率在皮肤恶性肿瘤中位居第一位,其发病机制迄今为止仍不明确。尽管在Mohs手术(Mohs micrographic surgery)、化疗、放疗、生物治疗、免疫治疗等方面取得了长足进步,但是由于发病率逐年增长,而面积较大、年老体弱、特殊部位、手术禁忌症患者等不适于接受Mobs手术的越来越多,又由于CSCC是侵袭性癌、恶性程度高、耐药性、易发生淋巴结、远处转移和晚期可通过血液播散,导致CSCC患者治疗后复发甚至死亡。外部环境因素以及遗传因素,细胞内癌基因突变、抑癌基因失活、凋亡过程和信号转导通路的异常等多种致病因素综合作用导致CSCC的发生、发展,这一研究结果提示皮肤鳞癌的发生发展是一个多因素、多基因、多阶段的复杂过程,它发生、发展的重要机制是细胞增殖与凋亡失衡。Livin(ML/KIAP, BIRC7)是新近发现的IAPs (inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族的新成员,直接结合天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases, Caspase),发挥较强的凋亡抑制功能,从而抑制细胞凋亡,促进肿瘤生长。Livin不仅在CSCC呈现高表达,并且在其它多种肿瘤组织中也呈现高表达,而Caspase-3和Smac(second mitochondria- derived activator of caspases, Smac)作为一种具有促凋亡功能的因子则往往低表达甚至缺失,这已被许多学者研究证实。Livin与Caspase-3和Smac这两种具有相反作用的因子通常呈负相关。RNAi (RNA interference, RNAi)技术沉默Livin基因表达,一方面抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡,另一方面增加肿瘤细胞对化疗的敏感性,表明Livin的高表达与肿瘤的发生、发展及预后相关。RNAi技术可高效、特异地下调目标基因的表达,是研究内源性基因功能和信号转导途径的强有力工具。本研究拟通过RNAi沉默Livin基因,建立沉默Livin基因表达的CSCC细胞株A431,在体内和体外通过一系列实验研究,观察Livin基因表达沉默后,CSCC细胞生长、增殖、凋亡、细胞周期、转移能力和克隆能力的变化情况；同时检测凋亡相关因子Caspase-3和Smac的表达水平的变化以及治疗皮肤鳞癌的化疗药物博来霉素(Bleomycin, BLM)耐药性的逆转并分析其可能机制,为皮肤鳞癌的治疗提供新的靶点和策略。课题共分四部分如下述。第一部分Livin和Smac基因在人皮肤鳞状细胞癌中的表达目的检测Livin和Smac在人CSCC组织、人CSCC细胞株A431和正常皮肤组织、人皮肤角质形成细胞株HaCaT中的表达,探讨Livin和Smac的表达及意义,以及Livin和Smac在CSCC组织中的表达与临床病理特征的关系。方法1.选择2009年1月至2011年8月整形外科手术切除并经病理学确诊的人皮肤鳞癌组织标本50例,正常皮肤组织标本20例。2.培养人皮肽鳞状细胞癌细胞株A431、人皮肤角质形成细胞株HaCaT。3.免疫组化SP法检测CSCC组织与正常皮肤组织中Livin和Smac蛋白表达,根据阳性细胞百分比和染色强弱综合判断两种蛋白的表达水平,并分析其相关性。4.采用Western blot、荧光定量RT-PCR检测Livin和Smac在人CSCC细胞株A431与人皮肤角质形成细胞株HaCaT的表达。5.分析Livin和Smac与临床病理因素的关系。结果1.Livin及Smac表达主要定位于CSCC细胞的细胞质,为棕黄色颗粒。50例cscc组织中Livin阳性表达率为70.0%(35/50),正常皮肤组织中无阳性表达,CSCC组织中Livin蛋白的阳性表达明显高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P<0.05);Smac蛋白阳性表达率为46.0%(23/50),在正常皮肤组织中Smac表达率为100%, Smac蛋白的阳性表达低于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P<0.05)。2. Livin mRNA和Livin蛋白在人CSCC细胞株A431中的相对表达量分别为0.842+0.191和0.828+0.230,在人皮肤角质形成细胞株HaCaT中分别为0.249±0.023和0.175±0.020。Livin mRNA和Livin蛋白在人CSCC细胞株A431表达明显高于人皮肤角质形成细胞株HaCaT,差异有统计学意义(P<0.05);Smac mRNA和Smac蛋白在人CSCC细胞株A431中的相对表达量分别为0.328±0.038和0.231±0.032,在人皮肤角质形成细胞株HaCaT中分别为0.824±0.183和0.808±0.215。Smac mRNA和Smac蛋白表达低于人皮肤角质形成细胞株HaCaT,差异有统计学意义(P<0.05)。3.Livin和Smac蛋白的表达与CSCC的发病年龄、性别、肿瘤大小等差异均无统计学意义(P>0.05)；而与是否发生转移以及肿瘤的分化程度差异有统计学意义(P<0.05);Livin和Smac的表达从强到弱分别为：低分化、中分化、高分化,正常皮肤组织无表达和正常皮肤组织、高分化、中分化、低分化,且二者表达呈负相关。小结1. Livin和Smac基因在人CSCC组织和人CSCC细胞系中分别呈高表达和低表达,与肿瘤的转移以及分化程度相关。2. Livin和Smac在CSCC组织中的表达呈负相关。第二部分Livin基因siRNA真核表达载体的构建和鉴定目的构建人Livin基因Livin-siRNA真核表达载体并进行鉴定,探讨RNAi沉默靶基因的效果及其在靶细胞内稳定表达的情况,为研究Livin基因功能提供稳定的转染载体。方法1.设计2个针对Livin基因的siRNA靶片段,合成短发夹DNA单链,退火形成双链DNA片段。2.DNA片段与pSilencer2.1/U6载体连接和转化,经筛选并进行酶切和测序鉴定插入序列,得到正确的2个针对Livin基因的siRNA载体。3.细胞经培养后分组为沉默Livin 1组：转染pSilencer2.1/U6-si438;沉默Livin2组：转染pSilencer2.1/U6-si475;空载体组：转染pSilencer2.1/U6;空白对照组：未转染的A431细胞。4.制备shRNA-LipofectamineTM 2000复合物f稀释质粒pSilencer2.1/U6-si438 or pSilencer2.1/U6-si475 or pSilencer2.1/U6和稀释LipofectamineTM 2000轻轻混合孵育形成),按分组转染CSCC A431细胞。5.经G418筛选扩增后得到对应的稳定转染细胞株,采用Real-time-quantitative-RT-PCR和Western blot检测转染的A431细胞Livin mRNA和Livin蛋白的表达。结果1.据GenBank中Livin基因已知序列(No.NM-139317, No.NM-022161, BIRC7 baculoviral IAP repeat containing 7 [Homo sapiens], Also known as KIAP, LIVIN, MLIAP, RNF50, ML-IAP, CDS 1741070),利用GeneLinkTM公司的RNAi Explorer和Dharmacon公司的siDESIGN Center进行扫描,经BLAST同源性分析,选择确定19个碱基438-456(GTGGTTCCCCAGCTGTCAG),475-493(GGAAG AGACTTTGTCCACA)为2条针对Livin基因的干扰序列,合成两对DNA单链为编码短发夹RNA序列,在两端分别加上BamHI和HindⅢ内切酶残基,并命名为Livin438和Livin475,退火形成双链DNA片段(si438和si475)。2.DNA片段与pSilencer2.1/U6载体连接和转化后,经筛选并进行酶切和测序鉴定插入序列,证实得到的2个针对Livin基因的siRNA载体pSilencer2.1/ U6-si438和pSilencer2.1/U6-si475与设计的一致。3.沉默Livinl组f转染pSilencer2.1/U6-si438)、沉默Livin2组(转染pSilencer2.1/U6-si475)和空载体组(转染pSilencer2.1/U6)细胞经G418筛选,均得到稳定转染细胞株。4. Livin mRNA和Livin蛋白相对表达量在空载体组分别为0.826+0.205和0.813±0.189,在空白对照组分别为0.852+0.197和0.832+0.202。空载体组和空白对照比较,Livin mRNA和Livin蛋白表达水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);Livin mRNA和Livin蛋白相对表达量在沉默Livin 1组分别为0.253+0.031和0.233+0.024,在沉默Livin 2组分别为0.132+0.031和0.128+0.031。沉默Livin 1组、沉默Livin 2组细胞与2个对照组比较,Livin mRNA和Livin蛋白表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),基因沉默效应均达到70%以上；沉默Livin2组细胞Livin mRNA和Livin蛋白的相对表达量最低。小结1.成功构建2个针对Livin的siRNA载体,获得最佳干扰序列pSilencer2.1/ U6-si475载体及2株Livin表达沉默的皮肤鳞癌A431细胞株。2.通过RNAi技术可以沉默靶细胞Livin基因,转染入皮肤鳞癌细胞后可达到70%以上的基因沉默效应,可在转录水平及蛋白水平抑制目的基因Livin的表达。第三部分RNAi干扰Livin基因表达对皮肤鳞状细胞癌细胞株生物学功能的影响目的探讨RNAi干扰Livin基因表达对CSCC细胞株生物学功能的影响及可能机制,为进一步的临床试验提供科学的实验依据。方法1.体外实验分组为沉默Livin组：稳定转染pSilencer2.1/U6-siLivin的A431细胞,沉默Livin基因表达；空载体组：稳定转染空载体pSilencer2.1/U6的A431细胞；空白细胞组：未转染的A431细胞。2.采用荧光定量RT-PCR, Western blot检测Smac mRNA, Smac蛋白在各组细胞的表达水平；ELISA检测Caspase-3的活性。3.MTT法测定细胞的增值和耐药性影响。4.流式细胞仪检测细胞凋亡和周期变化。5.Transwell小室细胞迁移实验检测细胞的转移能力。6.克隆形成实验检测细胞的克隆能力。结果1.沉默Livin组f稳定转染pSilencer2.1/U6-siLivin的A431细胞)与空白细胞组(未转染的A431细胞)和空载体组(稳定转染空载体pSilencer2.1/U6的A431细胞)相比,Smac的mRNA、蛋白表达水平上升,分析结果差异有统计学意义(P<0.05);Caspase-3的活性显著升高,分析结果差异有统计学意义(P<0.05)。2.沉默Livin组与空载体组和空白细胞组相比,沉默Livin组细胞OD值显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)；沉默Livin组联合BLM治疗组的细胞凋亡率显著高于空载体组和空白细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.沉默Livin组与空载体组和空白细胞组相比,沉默Livin组细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；沉默Livin组细胞Go／G1期细胞比率显著升高,分析结果差异有统计学意义(P<0.05),S和G2/M期比率显著降低,分析结果差异有统计学意义(P<0.05)。4.沉默Livin组与空载体组和空白细胞组相比,沉默Livin组细胞穿膜细胞数显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)；沉默Livin组细胞克隆形成率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。小结1. pSilencer2.1/U6-siLivin沉默Livin基因后,可明显上调体外培养的人CSCC A431细胞的促凋亡蛋白Smac的表达,增加凋亡相关因子Caspase-3活性,从而抑制CSCC细胞增殖及转移能力,诱导凋亡。2. pSilencer2.1/U6-siLivin沉默Livin基因后,增强A431细胞对于BLM化疗的敏感性,逆转BLM耐药性。第四部分RNAi沉默Livin基因对皮肤鳞状细胞癌A431细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的探讨Livin特异性的siRNA在人CSCC细胞株A431裸鼠移植瘤中沉默Livin基因的表达情况及对移植瘤生长的抑制作用,为进一步临床试验提供基础。方法1.将人CSCC细胞株A431接种于裸鼠左腋下皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型。接种A431细胞后第8天将成瘤后的裸鼠随机分成空白对照组、空载体对照组、治疗组。2.分别向移植瘤空白对照组注射生理盐水(NS)、空载体对照组注射pSilencer2.1/U6质粒、治疗组注射重组质粒pSilencer2.1/U6-siLivin,检测观察肿瘤的生长情况,绘制肿瘤生长曲线,接种细胞后第33天处死裸鼠照相、剥取瘤组织称重,肿瘤组织适当处理后备用。3.H.E染色观察肿瘤组织的病理改变。4.应用荧光定量RT-PCR检测移植瘤组织中Livin和Smac mRNA表达,应用Western blot分别检测Livin蛋白、Smac蛋白和Caspase-3蛋白的表达水平。结果1.裸鼠接种A431细胞后第8天时成瘤,治疗组瘤体生长较缓慢,肿瘤的体积明显低于空白对照组和空载体对照组。2.治疗组瘤体的平均重量较轻(0.58+0.03)g与空白对照组(1.27+0.08)g和空载体对照组(1.24+0.05)g比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3.治疗组肿瘤生长受到抑制,肿瘤细胞坏死、凋亡增加。4.治疗组与空白对照组和空载体对照组比较,Livin mRNA和蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05), Smac mRNA和蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05), Caspase-3蛋白表达水平亦显著升高。小结1.沉默Livin可以有效抑制皮肤鳞癌A431细胞在裸鼠成瘤实验中移植瘤的生长。2.沉默Livin基因后,Smac和Caspase-3蛋白表达水平显著升高,与体外实验结果一致。1.Livin和Smac基因在人皮肤鳞状细胞癌组织和A431中分别呈高表达和低表达,表达呈负相关,与肿瘤的转移以及分化程度相关。2.构建2个针对Livin的siRNA载体,筛选得到最佳干扰序列pSilencer2.1/ U6-si475载体和Livin表达沉默的皮肤鳞癌A431细胞株。3. pSilencer2.1/U6-siLivin沉默Livin基因后,可明显上调体外培养的人皮肤鳞癌细胞A431的促凋亡蛋白Smac的表达,增加凋亡相关因子Caspase-3活性,从而抑制皮肤鳞癌细胞增殖及转移能力,诱导凋亡。4.pSilencer2.1/U6-siLivin沉默Livin基因后,可增强A431细胞对于BLM化疗的敏感性,逆转BLM耐药性。5.体内体外实验结果均显示沉默Livin可以有效抑制皮肤鳞癌A431细胞增殖,诱导凋亡。