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漆酶(EC1.10.3.2)是自然界广泛分布的多铜氧化酶家族中的一个成员。它通过四个铜离子的协同作用从底物转移电子到受体同时使空气中的氧分子还原成水，一大类酚及非酚类化合物都能作为它的底物。漆酶广泛存在与植物和真菌中，在细菌中也有发现。同植物及真菌漆酶比较，细菌漆酶可能比真菌漆酶有更多的优点，如不需糖基化、热力学稳定性好，酶活最适pH广泛等。利用细菌发酵系统生产细菌漆酶，既可以增加漆酶的种类，也可能克服漆酶产量低的问题。因此，从细菌中发现漆酶蛋白并进行开发利用是当前国外重视的一个研究的课题。
本实验室已经从土壤中筛选到一株产漆酶菌Klebsiella sp.601并成功克隆出漆酶的编码序列。对该细菌漆酶酶学性质的研究发现，Klebsiella sp.601细菌漆酶的活性较低。鉴于大肠杆菌CueO蛋白的分子结构已经解析出来，使得利用现有的细菌漆酶的分子模型进行蛋白质工程改良Klebsiella sp.601细菌漆酶的活性成为可能。E.coli CueO分子模型分析显示E.coli CueO细菌漆酶与真菌漆酶在Cull结合位点与漆酶蛋白表面之间的可溶性物质通道的外侧和Cu I结合位点附近的底物结合区域有明显差异。两类漆酶在II型Cu2+与漆酶蛋白表面之间都有一个可溶性物质通道，不同的是在E.coli CueO的II型Cu2+的可溶性物质通道外侧存在一个Glu106，而在真菌漆酶的相同位置存在的是Phe69。此外真菌漆酶的I型Cu2+结合位点完全裸露，有利于底物与酶的结合，而E.coli CueO的I型Cu2+结合位点的外侧存在一个α-螺旋结构(351L-378G)，它的存在阻碍了底物与酶的结合。因此，我们使用PCR定位诱变的方法，利用高保真DNA聚合酶对Klebsiellasp.601细菌漆酶基因进行点突变和片段缺失，构建了Klebsiella sp.601细菌漆酶的三种突变体：E106F，△a351-378和E106F/△α351-378。
使用1 mmol/L IPTG在30℃诱导4小时后，SDS-PAGE显示突变体E106F能高效表达。表达的酶蛋白经Ni柱纯化后纯度达90％以上。对突变体E106F漆酶酶学性质研究发现：以DMP为底物时该酶的最适反应pH为5.0，以ABTS为底物时该酶的最适反应pH为4.0。在pH7.0左右时，突变体E106F稳定性较好。酶学分析显示，突变体E106F细菌漆酶在pH5.0、37℃条件下催化DMP氧化反应的Km值为2.46×10-4mol/L，kcat值为1.19×106s-1，kcat/Km值为4.84×109 L·mol-1·s-1；在pH4.0，37℃条件下催化ABTS氧化的Km值为1.95×10-3mol/L，kcat值为2.59×106s-1，kcat/Km值为1.32×109 L·mol-1·s-1；在pH8.0，37℃条件下催化SGZ氧化反应的Km值为1.67×10-5mol/L，Kcat值为1.31×105s-1，kcat/Km值为7.84×109L·mol-1·s-1。酶动力学分析表明，与野生型Klebsiella sp.601相比，突变体E106F的酶活力有很大改善。
突变体△a351-378和E106F/△a351-378基因在大肠杆菌宿主细胞中表达正常，但都形成了不溶的蛋白包涵体。非变性胶酶活性染色法未检测出这两种突变酶的漆酶活性。